猪囊尾蚴病诊断技术.docx

猪囊尾蚴病诊断技术猪囊尾蚴病诊断技术1范围本标准规定了猪囊尾蚴病的病原分离与鉴定和酶联免疫吸附实验(ELISA)两种诊断技术本标准适用于猪囊尾蚴病的诊断和流行病学调查以及检疫。2病原分离与鉴定2.1病原分离2.1.1样品采集采集猪的咬肌、舌肌、内腰肌、膈肌、肋间肌、肩胛肌等，亦可采集脑、心脏、肝脏、肺脏2.1.2样品分离成熟的猪囊尾蚴为长椭圆形(6毫米10毫米)*5毫米，半透明的囊壁内充满液体，上有一个黍粒大小的白色小结节即为头节(SCOLEX)和颈节(NECK)。脑内寄生的则为圆球形8毫米10毫米。将上述任何部位的囊尾蚴，以手术刀和镊子剖离后，以生理盐水洗净，并用滤纸吸干。2.2病原鉴定2.2.1分离样品的鸦片制备以剪刀剪开囊壁，取出完整的头节，再以滤纸吸干囊液后，将其置于两张载玻片之间并压片，于两张载玻片间加入12滴生理盐水后置于显微镜下镜检。2.2.2镜检以低倍(物镜8倍、目镜5倍)观察囊尾蚴头节的完整性。2.2.3结果判定低倍镜检，可见到头节的顶部有顶突，顶突上有内外两圈排列整齐的小钩，顶突的稍下方有四个均等的圆盘状吸盘，即判为猪囊尾蚴。3酶联免疫吸附试验(ELISA)3.1材料准备3.1.1器材ELISA反应板、酶联免疫检测仪、加样板、洗瓶、10厘米*1厘米普通滤纸条等。3.1.2试剂猪囊尾蚴层析抗原、葡萄球菌A蛋白(SPA)辣根过氧化物酶(HRP)标记物(HRPSPA)、猪囊尾蚴标准阴性和阳性全血滤纸片等。3.1.3被检猪全血血片将10厘米*1厘米普通滤纸条的一段标记被检猪号码，另一端吸取被检猪任何部位血液12滴，于室内阴干后，置于4度冰箱内(可保存6个月)。3.1.4溶液配制溶液配置的方法见附录A(标准的附录)。3.2操作方法3.2.1.1首先以抗原包被液(见附录A中A1)洗涤ELISA反应板各三次。3.2.1.2以抗原包被液将抗原使用说明书稀释至工作浓度。3.2.1.3用加样器加工作浓度抗原至ELISA反应板各孔内，每孔0.1毫升，加盖后置于室温(1129)过夜。注：包被过夜的WLISA反应板加盖后置于冰箱冷冻室内(可保存6各月)，或将包被过夜的ELISA反应板按3.2.2方法洗涤后，晾干，装入塑料袋内密封，置于4冰箱内。(可保存4个月)。3.2.2洗涤用力甩净包被过夜的ELISA反应板孔内的抗原包被液，每孔加入洗涤液(见附录A中A2)，浸泡3分钟后，用力甩去洗涤液，并用滤纸吸去残留的洗涤液和驱除孔内气泡，重新加入洗涤液，按同样方法共洗涤三次，即3*3分钟冲洗.。3.2.3血片的处理将被检血片、标准阴性血片及标准阳性血片均剪成1厘米*1厘米大小，分别置于青霉素瓶内，每1厘米*1厘米血片加入稀释液(见附录A中A2)0.3毫升，浸泡20分钟，即血片变白后即可。3.2.4加样3.2.4.1每份被检血片浸液加两孔，每孔0.1毫升。3.2.4.2标准阴性、标准阳性对照孔内相应血片浸液两孔，每孔0.1毫升。3.2.4.3空白对照孔加稀释液两孔，每孔0.1毫升。3.2.4.4加样后加盖，于室温(1129)放置30分钟。3.2.5洗涤方法同3.2.2。3.2.6加酶标记SPA。3.2.6.1HRPSPA标准物按使用说明书以稀释液稀释至工作浓度。3.2.6.2被检孔、标准阴性孔每孔加HRPSPA标记物0.1毫升。3.2.6.3空白对照孔亦加0.1毫升。3.2.6.4加完后加盖，于室温(1129)放置30分钟。3.2.7洗涤方法同3.2.23.2.8加底物每孔加现配置的底物溶液(见附录A中A3)0.1毫升，于室温(1129)放置10个月。3.3判定在对照孔成立的前提下，即在标准阳性孔呈深黄色，标准阴性孔呈无色或浅黄色，空白孔呈无色，判定检验结果。3.3.1目测判定与标准阴性孔相比，颜色深于标准阴性孔者，即判定为ELISA法阳性病猪(+)。3.3.2酶联免疫检测仪判定(490纳米)以空白对照孔调零，测定被检孔透光(OD)值。当OD<0.22，判定为ELISA法阴性()；当OD>0.26判定为ELISA法阳性(+)；当0.23