猪细小病毒病诊断与预防3.docx

猪细小病毒病诊断与预防3Krell等(1988)率先将核酸探针技术应用于PPV的诊断，他们将以PPVRFDNA酶切得来的3.0kb的DNA片段用放射性同位素标记后，作为探针通过打点杂交检测培养细胞中的PPV。结果发现最低可检测0.1pgDNA。与HA的比较结果表明，该方法比HA敏感100倍以上。国内吴保成等(1992)对PPVRFDNA的HindIII和PstI片段，进行生物素标记后用作探针进行斑点杂交。结果发现，该探针能检测到约100pg的PPVDNA。侯喜林等(1997)同样利用PPVDNA的HindIII和PstI片段进行地高辛标记后用作探针检测PPVDNA，结果能与其自行分离的7株PPV毒株的DNA杂交，最低检出限量为40pgDNA。之后，他们又将该探针用于临床检测PPV感染获得成功(侯喜林等，1998)。地高辛标记探针与放射性标记探针相比具有相同的敏感性，并且克服了生物素标记探针敏感性差、背景深的特点，因此是探针标记中较为理想的方法。核酸探针技术用于PPV抗原的检测比HA试验敏感、特异性强，适宜于实验室进行PPV感染的诊断，但该方法的技术含量高，只能在专业实验室应用，不适合大面积临床诊断和现场应用。1985年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室Mullis等人发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应（PCR），使人们梦寐以求的体外大量扩增核酸片段的愿望成为现实。之后，该技术应用到了疾病诊断方法中。Moliter等(1991)根据PPV基因组序列设计了一对引物，扩增VP2基因中158bp的片段，利用酶切和探针杂交证实了扩增产物的特异性，同时对四株PPV及CPV、PRV的扩增结果进一步证实了PCR反应的特异性，该方法至少可以检出100fg的PPVDNA，相当于1PFU的PPV量。国内，赵俊龙等利用扩增PPVVP2基因中的445bp片段，使PCR诊断结果更易于判读，同时建立了PPV和PRV二联诊断方法。综上所述，用于PPV感染的诊断方法很多，各种方法具有不同的优缺点，相对而言，目前应用较多的是HA和HI试验，这两种方法基本能满足常规的病原检测和血清流行病学调查等需要。要得到病原学的确诊，则最好利用病毒分离鉴定方法，这时免疫荧光技术经常成为首选。