2022年高级植物病毒学 .pdf
高级植物病毒学第一讲1.病毒： 病毒是一组一种或一种以上RNA 或 DNA 核酸模板分子，包被在蛋白或脂蛋白外壳内， 在合适的寄主细胞内， 依赖于寄主蛋白合成体系、 细胞物质和能量完成其复制，随着核酸的变化而发生变异。2.病毒与其他类似生物的区别：与细胞型寄生物的区别 ：在细胞内复制期间没有一个连续的膜将病毒与其寄生分开。在寄主细胞内复制的细胞性寄生物总是以一个连续的双层膜continuous bilayer membrane 与寄主细胞的细胞质分开病毒中缺少蛋白质合成的系统。病毒的复制是通过先合成许多组分, 随后从组分库中装配出许多病毒粒体virion 或 virus particle 。即使最简单的细胞亦通过二分裂方式进行复制。与质粒的区别 ：正常的病毒具有粒子形态，其结构是为在细胞外的环境中保护遗传物质而设计的，并且能够促进病毒进入新的寄主细胞。病毒基因组为特定的病毒功能而高度地组织化，对寄主细胞没有已知的价值, 然而质粒的遗传物质通常对其寄主细胞的生存是有用的。病毒能引起寄主生物的病害或细胞的死亡，但是质粒不会。与衣原体、立克次氏体、支原体的区别：大小: 一些痘病毒 pox virus比衣原体的原体更大。基因组的性质和大小 : 许多病毒有像细胞一样的双链DNA, 并且一些病毒的DNA 比衣原体中的 DNA 大。DNA 和 RNA 的存在病毒和支原体都没有坚硬的细胞包膜。在活的寄主细胞外面，病毒与许多类群的专性细胞性寄生物 cellular parasite 如衣原体都不能生长。病毒和衣原体中没有产生能量的系统。病毒和某些细菌所需的氨基酸等完全依赖于寄主细胞。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 9 页植物病毒学 植物病毒研究方法 植物病毒种类的分子鉴定Plant Virology微生物学报 植物保护学报 植物病理学报 Plant Disease 、 Phytopathology、Molecular Plant Microbe Interactions、Molecular Plant Pathology、Virus Genes 、Archives of Virology 、Virus Research 、Journal of General Virology第二讲1.类病毒： 不具病毒粒体，而是裸露的RNA，能侵染细胞，进行自我复制，称为类病毒。2.卫星核酸： 是指依赖于辅助病毒才能复制的线状和环状小分子核酸，其核酸序列与其辅助病毒无显著的同源性，包装在辅助病毒衣壳蛋白内。3.卫星病毒： 具有独立的核酸和外壳蛋白、必须依赖于辅助病毒才复制的病毒，并与辅助病毒无同源性。一般干扰辅助病毒的复制。4.拟病毒： 包被于辅助病毒衣壳内、 类似于类病毒的卫星RNA， 大小为 300-400bp，具有高度二级结构的单链闭合环状RNA 分子。5.蛋白侵染因子： 不含核酸，只含约30kDa 蛋白质侵染因子，病因未完全明确，暂不列入亚病毒。第三讲病毒的核酸类型1正单链 RNA+ssRNA ：单链 RNA 具有侵染性，可以直接翻译， 起 mRNA的作用。大部分重要植物病毒的基因组属这一类型。如 TMV ，CMV ，PVY；多分体病毒。2负单链 RNA-ssRNA ：病毒粒体中的单链RNA 不具侵染性，必需先转录成互补链，才能翻译蛋白。植物弹状病毒的基因组属这一类型，如NCMV 。3双链 RNAdsRNA ：其中一条链具有mRNA 的作用。负链变正链才能作为 mRNA。植物呼肠孤病毒的基因组属这一类型，如RDV。4单链 DNAssDNA ： 联体病毒科病毒含有这种类型基因组，复制时单链DNA 先合成双链 DNA ，再以常规途径转录生成mRNA，如 WDV 。5 双链 DNA dsDNA ： 核酸类型与高等动、植物的相同，为互补的双链 DNA，精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 9 页如 CaMV，杆状 DNA 病毒属具有这种类型基因组。 。第四讲1.病毒基因组结构：一般来讲，病毒基因组包括编码区coding regions和非编码区 (non-coding regions)。编码区所表达的蛋白要参与病毒的侵染循环、病毒在植株内的运动及植株间的传播以及与寄主植物的互作。非编码区调控基因组的复制与基因表达，但调控序列也可能存在于编码序列内。2.病毒基因组的特点：基因组大小相差很大： WDV ：2.75 kb 痘病毒： 300 kb核酸结构多样性： DNA 或 RNA；单链或双链；环状分子或线性分子基因组有连续的，有不连续的：大多数连续；RDV：12 条 dSRNA编码序列 90%(基因组 )多为单拷贝，即每个基因只出现一次基因有连续的和间断的(有内含子 )相关基因丛集 : 功能上相关的基因排列在一起有重叠基因含有不规则结构基因：基因之间无间隔区；mRNA端无帽子结构；结构基因本身无翻译起始序列多聚蛋白策略：按病毒基因组的5 3方向进行翻译，形成一个大的多肽，这其中包含某种蛋白酶，再进行翻译后的切割，把一个Polyprotein 分成几个有功能的多肽。该策略在马铃薯Y 病毒科的病毒中普遍存在。多聚蛋白的策略能克服非 5端的起始密码子问题外， 还能使几个功能蛋白同时表达，更加容易调节整个生化途径。亚基因组 RNA 策略：亚基因组 RNAssgRNA是在病毒的复制过程中从基因组 RNA 上合成的具有截短的5端和共同的 3端的基因组分。原来在下游的编码框就变成 mRNA 的 5末端。当在基因组的3末端有几个基因存在时，一系列具有共同 3末端的 sgRNA 产生。中间起始策略： 翻译不是从 5端的 AUG 启动子开始的， 而是起始于中间的核糖体进入位点 IRES或核糖体着陆点。 IRES 形成一个复杂的二级或三级结构以精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 9 页使核糖体和激活因子结合。略读策略： 40S 核糖体亚基开始从 RNA 的 5端开始扫描，但是并不是所有的都从第一个 AUG 开始翻译的。有时会略过第一个AUG，从后面的 AUG 开始起始翻译。在有些情况下， 40S 核糖体亚基在终止密码子的位置不离开RNA 链，又重新开始寻找下一个起始密码子。多分体基因组策略：多分体基因组病毒在病毒的复制循环中需要把基因组分成几个核酸片断。 DNA 病毒和RNA 病毒中都存在这方面的情况。对于正意的ssRNA 病毒来说，这个策略可以把基因放在每一个RNA 片断的 5末端并能直接翻译成蛋白产物。在70 个植物病毒属中， 28个有多组分基因组。4. 病毒基因组的非编码区的末端结构植物病毒的 ssRNA 基因组在其 5或 3末端形成特殊结构。15端帽子 cap结构：25连接蛋白：33端 Poly(A)结构43端类似 tRNA 结构：5互补的 5和 3序列第五讲1. RNA 病毒复制方式+ssRNA病毒的复制 ：+ssRNA病毒进入寄主后释放出RNA ，其 5端结合到寄主的核糖体上，它与寄主核糖体的亲和力比寄主的 mRNA 大 1000 倍。RNA释放并不是一下完成的，而是从5 端逐渐向外释放，然后顺5 3 来进行翻译，先翻译出 RNA聚合酶 RdRp ，及其它病毒专化蛋白，再从3 端开始复制整个基因组形成负链，再在负链上合成正链。最后外壳蛋白亚基和RNA 链组装成新的病毒粒体，聚集在细胞质中。-ssRNA病毒的复制 ：植物弹状病毒具有 -ssRNA基因组，与其复制有关的蛋白有核衣壳蛋白 N ，被认为是复制酶的1 种大蛋白 L和基质蛋白 M 。植物弹状病毒的 -ssRNA基因组有两个功能，作为mRNA 转录的模板以及作为复制模板。其细胞核弹状病毒的复制过程如下：、进入到细胞后，病毒与内质网ER 结合，把核蛋白壳核心释放到细胞质中。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 9 页、核蛋白壳核心经由核孔进入细胞核中。、在 L 蛋白的催化下进行早期转录，形成的mRNA 进入细胞质并翻译。、核心的复制酶蛋白N 、M2和 L 进入到细胞核中， 催化基因组 RNA 的复制并进行晚期 mRNA 的转录。、在细胞核的周边形成含有N、M2 和 L 蛋白的颗粒状电子浓密的病毒质体viroplasms , 病毒在此复制。、在复制的晚期， M蛋白与新合成的核蛋白核心结合并缠绕在上，该复合体再与 G蛋白结合，聚集在内核膜上。、新合成的病毒粒体进入核的外周空间。双链 RNA 病毒的复制细胞内的复制位点：在细胞质中复制，侵染后，在细胞质中可出现染色浓密的病毒质体。RNA 的装配：有 2 个识别信号，其一是对病毒的基因组特异的， 其二是对 10-12条 dsRNA 分子特异的。复制：在呼肠孤病毒中，负链是在病毒质体中由病毒复制酶以正链为模板合成的，形成的 dsRNA 最终装配成病毒粒体。2.病毒提纯的原则不同病毒往往依据提纯的目的和要求不同，设计不同的提纯方案：如1制作抗血清，尽量除去寄主的各种抗原成分2拟用于病毒核酸性质研究，尽量除去寄主的各类核酸或核酸衍生物设计具体的提纯方案设计时：1应查找前人资料，看是否前人资料能直接利用；2依据提纯目的和现有实验条件对前人方法进行改良；3依据病毒和繁殖寄主的特性创造提纯方法。从初提纯开始， 每一步最好用一定的检验方法对提纯中的病毒进行监测，如血清学检测、电镜观察、电泳分析、紫外扫描等。第六讲精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 9 页病毒在其生命过程中可因突变和重组产生变异。突变：病毒基因组核苷酸序列的任何改变被认为是一种突变，包括点突变、缺失和插入。点突变：主要发生在由于RNA 基因组在复制过程中低的准确性，特别是在RNA 复制过程中所涉及的酶病毒的RdRp 或复制酶缺乏校正活性所致。另一种可能的机制是称为RNA 编辑 RNA editing的转录后碱基的修饰过程。插入和缺失：插入可能是较长的RNA 片段或仅几个非模板的核苷酸，通常的情况下较长 RNA 片段的插入是由于RNA 重组所致，而少数几个非模板核苷酸的插入是由于在难被复制酶拷贝的模板区域RNA 复制酶的错误所导致。缺失常出现在缺陷干扰 RNA 中，象插入一样，缺失片段的大小从几个核苷酸到大片段的 RNA 分子。移码突变：当缺失或插入改变通常的遗传三联体密码子时，就会在翻译过程中发生核糖体的移码作用。突变体的稳定性：除了缺失突变外，多数突变体能够进行逆的突变，分为回复突变和补偿突变两种类型。重组：两个基因组之间发生遗传物质的交换称为重组。“ 典型” 重组：这种类型的重组在DNA 病毒以及具有 DNA 阶段的 RNA 病毒反转录病毒是普遍存在的，因为寄主细胞中具有DNA 重组的系统。RNA 重组：RNA-RNA 重组可发生在不同的病毒RNA来源于不同病毒或同一病毒，并有同源或非同源交换体的出现。前者发生在两个几乎相同的RNA或几乎相同的 RNA 区域，而后者发生在不相关的RNA 或不相同的区域间。缺陷干扰 DI RNA ：在 RNA 病毒的侵染过程中，经常伴有源于Helper 病毒基因组的 DI RNA 的存在，由于 DI RNA 干扰 Helper 病毒的积累， 它们对于控制Helper 病毒的病害严重度和对RNA 病毒进化适合性的各个方面起重要作用。表现型混合2. 血清学检测方法与原理酶联免疫吸附法：用酶作标记物或指示剂进行抗原和抗体定性、定量、定位测定的技术，灵敏度高 110ng/mg 病毒 、特异性强、操作简便，广泛用于病毒的诊断和鉴定。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 9 页直接法：用特异性酶标抗体直接检出样品中的抗原。间接法：用酶标记抗抗体检出抗原。双抗体夹心法：双抗体检出抗原的方法。斑点 ELISA 法：以硝酸纤维素膜作载体进行的ELISA 法。免疫双扩散法：以琼脂糖或琼脂凝胶作为扩散反应的介质，由抗原和抗体在介质扩散中相遇，而在某一位置上形成肉眼可见的沉淀线。免疫吸附电镜技术：将免疫与电镜技术结合，用以检测抗原和抗体特异性结合的方法。3.双链 RNA 分析和核酸鉴定技术双链 RNA 技术：植物基因组很少存在dsRNA，即使存在，其分子量很小，而RNA 侵染病毒后，在植物中都存在较大分子量的dsRNA分子量 1106)。因此，检测植物中dSRNA 存在，可以确定植物是否受到RNA 病毒的侵染，对于判断是否是 RNA 病毒侵染的有效检测方法。PCR 技术：在模板指导、引物引导、聚合酶催化的DNA 特异片段的周期性体外扩增反应。原理和程序：模板 DNA引物：人工合成的 DNA 片段 15-30bp) 周期性扩增：变性 9495 、退火37-60 、延伸72 第七讲MP 的十大特性：由于是一种非结构蛋白， MP不包装在病毒粒体中。有些病毒的细胞间运动要求CP的参与，即使在这种情况下，MP也独立于病毒粒体之外，但PVY是个例外，因为它的 CP具有 MP的一些性状。MP一般不参与病毒的复制过程：例如，CaMV 基因 I 编码 MP 的突变体可在原生质中复制，但不能在病株内扩展。MP有同源的序列：在 TMV 的 MP发现之后，几种其它病毒的MP也被发现有序列的同源性。病毒 MP 常常是暂时的表达：通常是在侵染的早期表达而在侵染后期下降。TMV MP精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 9 页的表达时间而不是表达量是运动的关键。MP是一类核酸结合蛋白：它们必须转运病毒核酸通过PD来完成其功能。一些MP促进病毒粒体通过PD ，而另一些以非病毒粒体的形式协助核酸的运输。对后一种形式来说， MP 必须是核酸结合蛋白。MP一般不是病毒专化的：许多的MP被确定为是非专化的核酸结合蛋白。一种不能在细胞间运动的病毒当接种另一种有运动能力的病毒辅助病毒 后，就可获得运动能力。MP通常定位在 PD ：PD定位作用对于 TMV MP 的功能是关键的，缺乏这种过程的突变体就丧失了细胞间运动能力。MP可修改 PD SEL ：病毒要在细胞间的扩展就必需经过PD 。由于 PD的 SEL小于病毒的核酸或病毒粒体，MP 必需增加 SEL使病毒核酸得以通过。MP可通过 PD运动：已有许多证据显示病毒的MP可穿过 PD 。MP促进核酸通过 PD的运动：由于 MP具有结合核酸和通过PD的能力，这就是MP促进病毒 DNA 或 RNA 在细胞间运动的原因。第八讲1. 植物病毒的传播方式植物病毒的传播按照在传播中的关系和作用分为两大类：非介体传播在病毒传递中没有其他有机体介入的传染方式。介体传播 在病毒传递中有其他有机体介入的传播方式，这种有机体被称为介体(Vector)，包括昆虫、线虫、真菌、菟丝子等。非介体传播：机械传播无性繁殖材料传播嫁接传播菟丝子传播种子和花粉传播介体传播：在传毒介体中，昆虫是最主要的介体，其中70%为同翅目的蚜虫、叶蝉和飞虱，而又以蚜虫为最主要的介体，大部分昆虫传毒的资料来于蚜虫传毒。此外，土壤存在的介体主要有线虫和真菌。线虫介体真菌介体螨类介体昆虫介体2.分类依据：病毒粒体特性：形态、基因组特性、蛋白质特性、脂膜有无等精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 9 页基因组结构和复制特性：基因组结构，核酸复制策略，转录特征，蛋白加工特性等病毒抗原性质：血清学关系和抗原决定簇定位生物学特性：寄主范围，致病性，传播途径，地理分布等3. 持久性传播： 介体从病株上获毒取食的时间很长，从10min 到 2h，取食时间愈长，传毒效率愈高；病毒在昆虫体内有循回期。4. 半持久性传播 ：获毒取食的时间为数分钟，增加获毒取食的时间可提高传毒效率；没有循回期，病毒在体内可保持13d，饥饿处理不能提高传毒效率。5. 非持久性传播： 介体从病株上获毒取食的时间很短，只要几秒钟到几分钟，取食时间愈长， 获毒效率愈低。 昆虫获毒后立即可以传毒， 病毒在昆虫体内没有循回期。预先的饥饿处理可提高取食和传毒效率。第九讲1. 免疫 : 植物受病毒自然侵染或人工接种后，其外观甚至内部组织不发生任何症状反应。2. 先天免疫性 ： 植物本身所固有的免疫特性，病毒不能与寄主建立寄生关系不是病毒的寄主。3. 后天免疫性 ：获得免疫性，通过生物、物理或化学方法诱导的免疫性。4. 交互保护 ：寄主植物当受到某种病毒的某一株系侵染后，能对同种病毒的其它株系的侵染起抑制作用，即弱株系阻止强毒株系的侵染。5. 缺陷病毒 ：干扰同种病毒或株系的侵染，病毒在感染时产生的亚基因组缺失突变体，不能单独复制，必须在同型病毒辅助下才能完成复制。6. 基因沉默 ：抗病毒基因工程，是广泛存在于动植物、真菌和线虫等真核生物中的一种高度保守的、序列特异的RNA 降解机制。7. siRNAs：短的干扰 RNA，源于长的双链 RNA 前体，包括基因组编码的重复序列、反向重复序列、转座子、反转录因子，或是细胞内的RdRp 催化产生。他们也可能源于外来的因子，如病毒侵染和具有发夹结构的转基因。siRNAs 引导序列特异性的转录体的降解，称之为转录后基因沉默PTGS或通过染色质修饰的转录沉默。8. miRNA ： 内源的 microRNAs， 源于长的 dsRNA 发夹结构并可靶向几类蛋白，特别是参与发育的转录因子。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 9 页
