CTAB法提取植物基因组DNA.doc

如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流CTAB法提取植物基因组DNA【精品文档】第 4 页CTAB法提取植物基因组DNACTAB法原理CTAB（Cetyl trimethyl ammonium bromide），十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)， CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。CTAB溶液在低于15时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。 主要试剂与溶液的配制：PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）巯基乙醇氯仿异戊醇（241）异丙醇70%乙醇Tris-苯酚RNaseA无水乙醇CTAB 溶液：CTAB20g/LNaCl（58.44）1.4 mol/L（81.816g）EDTA（292.25）10 mmol/L（2.9225g）Tris（121.14）100 mmol/L（12.114g）pH 8.01×TE 缓冲液：EDTA（292.25）1 mmol/L（0.29225g）Tris（121.14）10 mmol/L（1.2114g）pH 8.0NaAC溶液：NaAC（82.03）3mol/L（246.09g）pH 4.0植物总DNA的提取1、取适量甘薯新鲜叶片，用液氮迅速研磨，中间加PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）少许，成粉末后转入10mL的离心管中，放入液氮或-80冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的DNA量可以相差几倍，所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨几次）。2、将（200ml）CTAB溶液放于65水浴锅中预热。3、加4ml巯基乙醇到预热的200mlCTAB中。4、速加3ml预热的CTAB到装有粉末的10mL离心管中，之后放入65水浴锅中，保温3060min，期间轻摇数次（一般20min左右一次，刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔）。5、加入34ml氯仿异戊醇（241）（在通风橱中操作），轻摇混匀至乳白色（100200次，剧烈晃动会使DNA机械切割）。6、1520，11000 rpm离心15min（CTAB配平，相对应的离心管，质量相差<0.03g）。7、取上清（用剪过的枪头进行操作，过尖的枪头会把DNA链弄断。），加0.6倍体积的异丙醇，摇均（有絮状物析出，可放入4冰箱过夜）。8、用毛细玻璃管将DNA絮状物挑出（DNA絮状物尽量要挑出，不要离心，因为离心后虽然产量会增大，但是不完整的DNA也增多）（或4，10000 rpm离心5min，弃上清），放入新的离心管中，用70%乙醇漂洗2次，放置超净台中吹干。9、加入2ml 1×TE缓冲液溶解，可放入4冰箱保存（酶活性在4或65水浴中最低，防止酶降解DNA）。10、未溶解的，可放入65水浴中促其溶解，10min后拿出冷却至室温，可重复，直至溶解。11、加入2.5ul RNaseA（RNaseA提前拿出融化），10离心，升至4000 rpm即停，使RNaseA和溶液充分混合。12、37水浴，保温1h。13、加入1ml Tris-苯酚、1ml氯仿异戊醇（241），摇均配平，4，11000 rpm离心10min。14、取上清，加1×TE补至2ml，加2ml氯仿异戊醇（241）摇均配平，4，11000 rpm离心10min。15、如仍有白色蛋白质沉淀，则重复步骤14。16、取上清，加0.1倍上清液体积的NaAC，2.5倍上清液体积的无水乙醇（提前放入-20冰箱），摇均，放入-20冰箱沉淀30min。17、用毛细玻璃管将DNA挑出（或用无水乙醇配平，4，10000 rpm离心4min，弃上清），放入新的离心管中，用70%乙醇漂洗2次，转入1.5ml离心管，放置超净台中吹干。18、将DNA 溶于适量的1×TE缓冲液中，短期4保存，长期-80冰箱中储存。19、取少量DNA溶液进行琼脂糖电泳，胶浓度为0.8%，检测其完整性。并用紫外分光光度计测其浓度。注解：1、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 2、CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；3、NaCl：提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，在于液相中；4、EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；5、Tris (pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；6、-巯基乙醇：是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。7、苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：（1）有效变性蛋白质；（2）抑制了DNase的降解作用。缺点：（1）能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。（2）不能完全抑制RNase的活性。8、氯仿：克服酚的缺点，加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）。9、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。基因组DNA提取常见问题：1、DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质：重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA。2、DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应：让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)3、DNA中有RNA的存留：加入RNase降解RNA。4、材料不新鲜或反复冻融：尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。5、未很好抑制内源核酸酶的活性：在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量。6、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断：细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。7、外源核酸酶污染：所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。8、反复冻融。将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。冰冻材料提出高质量的基因组DNA，应确保以下几点：1、确保采样后立即投入液氮中保存。2、在磨样时一定要一直使材料处于低温状态。研磨前先将液氮倒入研钵，研钵彻底冷却后，再放入材料，研磨过程中，一定不要让液氮挥发净使材料回温，否则会DNA降解得很厉害。装管的时候，先将几个离心管放入一个装有液氮的容器内，将其冷冻一下，使之处于低温状态，将液氮还为挥发干净的材料放入管内，不要急着盖盖子，因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。将离心管放入盛有液氮的容器，等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。另外，如果是在离心管上编号，最好在冷冻前写好，否则离心管冷冻后材料会受影响不说，也很难写上。