分子标记的实验原理及操作流程(精).doc

Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date分子标记的实验原理及操作流程(精)分子标记的实验原理及操作流程(精) 一 AFLP 分子标记实验扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism(AFLP 是在随机扩增多 态性 (RAPD 和限制性片段长度多态性 (RFLP 技术上发展起来的 DNA 多态性检测技术, 具有 RFLP 技术高重复性和 RAPD 技术简便快捷的特点, 不需象 RFLP 分析一样必须制备探针, 且与 RAPD 标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征,同时弥补了 RAPD 技术重复性差的缺陷。 同其他以 PCR 为基础的标记技术相比, AFLP 技术能同时检测到 大量的位点和多态性标记。 此技术已经成功地用于遗传多样性研究, 种质资源鉴定方面的研 究,构建遗传图谱等。其基本原理是:以 PCR(聚合酶链式反应 为基础, 结合了 RFLP 、 RAPD 的分子标记技术。 把 DNA 进行限制性内切酶酶切,然后选择特定的片段进行 PCR 扩增 (在所有的限制性片段两 端加上带有特定序列的 “ 接头 ” , 用与接头互补的但 3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行 特异 PCR 扩增, 只有那些与 3-端严格配对的片段才能得到扩增 , 再在有高分辨力的测序胶上 分开这些扩增产物,用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。一、 实验材料采用青稞叶片提取总 DNA 。二、 实验设备1. 美国贝克曼库尔特 CEQ8000毛细管电泳系统,2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机,3. 美国 MJ 公司 PCR 仪,4. 安玛西亚电泳仪等。三、 实验试剂1. 试剂:请使用高质量产品,推荐日本东洋坊 TOYOBO 公司的相关产品。DNA 提取试剂盒;EcoRI 酶,MseI 酶,T4连接酶试剂盒;Taq 酶,dNTP, PCR reaction buffer; 琼脂糖电泳试剂:琼脂糖,无毒 GeneFinder 核酸染料替代传统 EB 染料; 超纯水(18.2M ·cm2.其他实验需要物品微量移液枪(一套及相应尺寸 Tip 头,PCR 管,冰浴等。四、 实验流程1、 总 DNA 提取使用 DNA 提取试剂盒提取植物基因组 DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑 胶检测。一般来说, 100ng 的基因组 DNA 作为反应模板是足够的。2、 EcoR1酶消化 (20ul 体系 /样品EcoR1 1ul10×Buffer 2ul 37 65 30min终止反应 sample(总 DNA 5ulddH 2O 12ul3、 Mse1酶消化 (20ul 体系 /样品Mse1 2ul (1U/ul10×Buffer 2ulsample(EcoR1酶切产物 80 30min终止反应 ddH 2O 1ul4、 T4 DNA Ligase(20ul 体系 /样品T4 DNA Ligase 2ul(1U/ul10×Buffer 2ulsample(双酶切产物 10ulMse1 Adaptor 1ul 2265 10min终止反应 EcoR1 Adaptor 1ulddH 2O 4ul5、 预扩增 (20ul 体系 /样品sample 4ulPrimer(Mse1/EcoR1 1ul AFLP Core Mix 15ul* AFLP Core Mix 配方:ddH 2O 13.8ulMgCl 2 1.6uldNTPs(2.5mM 1.6ulTaq 酶 (1U/ul 1ul10×Buffer 2ul预扩增程序:94 2min945672 2min60 30min6、选择性扩增 (20ul 体系 /样品sample 4ul(预扩增产物稀释 20倍 Primer(Mse1-XXX/EcoR1-XXX 1ulAFLP Core Mix 15ul选择性扩增程序:94 2min94 20s66 30s 每循环降 1,共 10个循环 72 2min94 20s56 30s 20个循环72 2min60 30min7、产物电泳检测上样液:Loading Buffer 20ulSize standard-600 0.2ul Sample 3ul(稀释 10倍 四、实验结果与分析本实验使用贝克曼库尔特 (BeckmanCoulter 公司 CEQ8000遗传分析系统, 运用先 进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验, 扩增产物在高分辨率毛细管中电泳 分离,采用激光激发荧光采集数据,灵敏度极高,电泳结果通过软件自动统计分析并转 换成“ 0、 1”矩阵,便于对结果进一步深入分析研究,整个电泳、数据采集和数据分析 过程由软件来控制完成,最大程度避免了人工操作造成的误差,提高了数据的可靠性。 产物电泳数据采集在 CEQ8000遗传分析系统上进行(图 1 ,得到的数据(图 2用第三方软件再进一步统计分析。 图 1 AFLP分子指纹图谱 图 2 AFLP“ 0、 1”矩阵图 AFLP 操作流程图:酶切Mse1酶切 优化 数据分析附录 1:常用的 8对 AFLP 选择性扩增引物:E-AGG: 5-GACTGCGTACCAATTCAGG -3E-ACG: 5-GACTGCGTACCAATTCACG -3E-AAC: 5-GACTGCGTACCAATTCAAC -3E-ACA: 5-GACTGCGTACCAATTCACA -3E-AGC: 5-GACTGCGTACCAATTCAGC -3E-ACT: 5-GACTGCGTACCAATTCACT -3E-AAG: 5-GACTGCGTACCAATTCAAG -3 Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站: 地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706E-ACC: 5-GACTGCGTACCAATTCACC -3M-CAA: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAA -3 M-CAC: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAC -3 M-CAG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAG -3 M-CTA: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTA -3 M-CAT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAT -3 M-CTC: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTC -3 M-CTG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTG -3 M-CTT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTT -3附录 2:AFLP 传统垂直板电泳 (银染法检测 介绍:原理与方法同前,区别:1. 选择性扩增引物不带荧光标记; 2. 电泳方法不同,采用测序 胶垂直板电泳; 3. 电泳结果采用银染法,比较直观,但条带的统计与分析全人工化,工作量 大,银染法灵敏度比荧光标记法要低。示例:下图为玉米(maizeDNA的 AFLP 图谱。 Panel A: AFLP fingerprints of control maize DNA using EcoR1 primer E-AGG with eight Mse1 primers: M-CAA (1, M-CAC (2, M-CAG (3, M-CAT (4, M-CTA (5, M-CTC (6, M-CTG (7, and M-CTT (8.Panel B: AFLP fingerprints of control maize DNA using Mse1 primer M-CAG with eight EcoR1 primers: E-AAC (a, E-AAG (b, E-ACA (c, E-ACT (d, E-ACC (e, E-ACG (f, E-AGC (g, and E-AGG (h.Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站:地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站:地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706 二 ISSR分子标记的实验原理及操作流程ISSR(inter-simple sequence repeat标记是一种类似 RAPD,但利用包含重复序列 并在 3 或 5 锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统,即用 SSR 引物来扩增重 复序列之间的区域。其原理具体是,ISSR 标记根据生物广泛存在 SSR 的特点,利用在生物 基因组常出现的 SSR 本身设计引物,无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为 16-18个碱基序列, 由 1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成, 从而保证了引物 与基因组 DNA 中 SSR 的 5 或 3 末端结合,导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的 基因组节段进行 PCR 扩增。一、实验材料不同来源的 DNA(30-50ng/ul。二、实验设备PCR 仪, PCR 管或硅化的 0.5ml eppendorf管,电泳装置,凝胶成像仪。三、试剂1、 ISSR 引物:购买成品或根据加拿大 British Columbia大学设计的 ISSR 引物序列(见 附录自己合成。 2、 Taq 酶3、 10xPCR 缓冲液4、 MgCl 2:25mmol/L。 5、 dNTP :2.5mmol/L。四、操作步骤:1. 在 25ul 反应体系中,加入 模板 DNA 1ul (30-50ng ISSR 引物 1ul (约 5pmol 10xPCR Buffer 2.5ul MgCl 2 2uldNTP 2ulTaq 酶 1单位(U 加 ddH2O 至 25ul混匀稍离心 , 加一滴(约 20 ul矿物油。2. 在 PCR 仪中预变性 94 2分钟 , 然后循环 : 94 1分钟, 45 -68 40秒, 72 1-2分钟,共 40轮循环。3. 循环结束后 , 72 10分钟, 4保存。4. 取 PCR 产物 15ul 加 3ul 上样缓冲液 (6x于 1.6% 或 1.8% 琼脂糖胶上电泳 , 稳压 50-100 V(电压低带型整齐, 分辨率高 。5. 电泳结束,溴化乙锭染色 20分钟。6. 用凝胶成像仪观察、拍照。操作流程简图: 地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706 Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站: 地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706注:样品可以采用新鲜样品,硅胶干燥样品,标本等 DNA提取可采用CTAB或SDS法DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法附录 UBC Primer Set #9 (Microsatellite引物名称序列引物名称 序列801 ATA TAT ATA TAT ATA TT851 GTG TGT GTG TGT GTG TYG 802 ATA TAT ATA TAT ATA TG852 TCT CTC TCT CTC TCT CRA 803 ATA TAT ATA TAT ATA TC853 TCT CTC TCT CTC TCT CRT 804 TAT ATA TAT ATA TAT AA854 TCT CTC TCT CTC TCT CRG 805 TAT ATA TAT ATA TAT AC855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT 806 TAT ATA TAT ATA TAT AG856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC858 TGT GTG TGT GTG TGT GRT 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG859 TGT GTG TGT GTG TGT GRC 810 GAG AGA GAG AGA GAG AT860 TGT GTG TGT GTG TGT GRA 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC861 ACC ACC ACC ACC ACC ACC 812 GAG AGA GAG AGA GAG AA862 AGC AGC AGC AGC AGC AGC 813 CTC TCT CTC TCT CTC TT863AGT AGT AGT AGT AGT AGT Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站: 地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706814 CTC TCT CTC TCT CTC TA864 ATG ATG ATG ATG ATG ATG815 CTC TCT CTC TCT CTC TG865 CCG CCG CCG CCG CCG CCG 816 CAC ACA CAC ACA CAC AT866 CTC CTC CTC CTC CTC CTC 817 CAC ACA CAC ACA CAC AA867 GGC GGC GGC GGC GGC GGC 818 CAC ACA CAC ACA CAC AG868 GAA GAA GAA GAA GAA GAA 819 GTG TGT GTG TGT GTG TA869 GTT GTT GTT GTT GTT GTT 820 GTG TGT GTG TGT GTG TC870 TGC TGC TGC TGC TGC TGC 821 GTG TGT GTG TGT GTG TT871 TAT TAT TAT TAT TAT TAT 822 TCT CTC TCT CTC TCT CA872 GAT AGA TAG ATA GAT A 823 TCT CTC TCT CTC TCT CC873 GAC AGA CAG ACA GAC A 824 TCT CTC TCT CTC TCT CG874 CCC TCC CTC CCT CCC T 825 ACA CAC ACA CAC ACA CT875 CTA GCT AGC TAG CTA G 826 ACA CAC ACA CAC ACA CC876 GAT AGA TAG ACA GAC A 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG877 TGC ATG CAT GCA TGC A 828 TGT GTG TGT GTG TGT GA878 GGA TGG ATG GAT GGA T 829 TGT GTG TGT GTG TGT GC879 CTT CAC TTC ACT TCA 830 TGT GTG TGT GTG TGT GG880 GGA GAG GAG AGG AGA 831 ATA TAT ATA TAT ATA TYA 881 GGG TGG GGT GGG GTG 832 ATA TAT ATA TAT ATA TYC 882 VBV ATA TAT ATA TAT AT 833 ATA TAT ATA TAT ATA TYG 883 BVB TAT ATA TAT ATA TA 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 884 HBH AGA GAG AGA GAG AG 835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 885 BHB GAG AGA GAG AGA GA 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 886 VDV CTC TCT CTC TCT CT 837 TAT ATA TAT ATA TAT ART 887 DVD TCT CTC TCT CTC TC 838 TAT ATA TAT ATA TAT ARC 888 BDB CAC ACA CAC ACA CA 839 TAT ATA TAT ATA TAT ARG 889 DBD ACA CAC ACA CAC AC 840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 890 VHV GTG TGT GTG TGT GT 841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC891HVH TGT GTG TGT GTG TG Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站: 地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG892TAG ATC TGA TAT CTG AAT TCCC843 CTC TCT CTC TCT CTC TRA 893 NNN NNN NNN NNN NNN 844 CTC TCT CTC TCT CTC TRC 894 TGG TAG CTC TTG ATC ANN NNN845 CTC TCT CTC TCT CTC TRG895AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC846 CAC ACA CAC ACA CAC ART 896 AGG TCG CGG CCG CNN NNN NATG847 CAC ACA CAC ACA CAC ARC 897 CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTGG848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG 898 GAT CAA GCT TNN NNN NAT GTGG849 GTG TGT GTG TGT GTG TYA 899 CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCCA850 GTG TGT GTG TGT GTG TYC900ACT TCC CCA CAG GTT AAC ACA Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站:地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706三 RAPD分子标记的实验原理及操作流程RAPD 技术的全称是随机扩增多态性 DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,此技 术建立于 PCR 基础之上,使用一系列具有 10个左右碱基的单链随机引物,对基因组的 DNA 全部进行 PCR 扩增, 以检测多态性。 由于整个基因组存在众多反向重复序列, 因此须对每一 随机引物单独进行 PCR,单一引物与反向重复序列结合,使重复序列之间的区域得以扩增。 引物结合位点 DNA 序列的改变以及两扩增位点之间 DNA 碱基的缺失、 插入或置换均可导致扩 增片段数目和长度的差异, 经琼脂糖凝胶电泳分离后通过 EB 染色以检测 DNA 片段的多态性。一、实验材料不同来源的 DNA(30-50ng/ul。二、实验设备PCR 仪, PCR 管或硅化的 0.5ml eppendorf管,电泳装置,凝胶成像仪。三、试剂1、 RAPD 引物:购买成品或根据赛百盛(SBS 公司设计的 RAPD 引物序列 ( 2、 Taq 酶3、 10xPCR 缓冲液4、 MgCl 2:25mmol/L。 5、 dNTP :2.5mmol/L。四、操作步骤:1. 在 15ul 反应体系中,加入 模板 DNA 1ul (30-50ng RAPD 引物 1ul (约 5pmol 10xPCR Buffer 1.5ul MgCl 2 1ul dNTP 1ulTaq 酶 0.5单位(U 加 ddH2O 至 15ul混匀稍离心 , 加一滴(约 20 ul矿物油。2. 在 PCR 仪中预变性 94 2分钟 , 然后循环 : 94 1分钟, 36 1分钟, 72 1分 钟,共 40轮循环。3. 循环结束后 , 72 10分钟, 4保存。4. 在 15ul PCR产物中加 2ul 上样缓冲液 (6x于 1.6% 琼脂糖胶上电泳 , 稳压 50-100V。5. 电泳结束,溴化乙锭染色 20分钟。6. 用凝胶成像仪观察、拍照。操作流程简图:Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站:地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706 注:样品可以采用新鲜样品,硅胶干燥样品,标本等DNA提取可采用CTAB或SDS法DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站: 地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706青岛昊航科贸有限公司 四 SSR 标记的实验原理及操作流程 SSR 简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称 SSR 标记），也叫微卫星序列 重复，是由一类由几个核苷酸（15 个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列， 长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造 成了 SSR 长度的高度变异性，由此而产生 SSR 标记或 SSLP 标记。虽然 SSR 在基因组上的位 置不尽相同， 但是其两端序列多是保守的单拷贝序列， 因此可以用微卫星区域特定顺序设计 成对引物，通过 PCR 技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示 SSR 位点在不同个体间的多态 性。 优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上； （2）是共显性标记，呈孟德尔遗传； （3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。 缺点：开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高。 操作程序： 取叶片磨样提取 DNAPCR 扩增电泳检测染色读带标记 1、DNA 提取 按照 Doyle 和 Dickson(1987CTAB 法（Cetyl triethyl ammonium bromide） 并略加改进的程序进行，具体步骤如下： 成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状，转入 1.5ml 离心管中，-20冰箱保存； 加入 600ul 65的 2×CTAB 混匀并置于 65水浴中保温 3060 分钟； 取出，冷却，上下摇匀后，加入 600 微升 24:1 的氯仿异戊醇； 12000 转/分钟离心 10 分钟，取上清液于另一个 1.5ml 的离心管中； 加异丙醇，12000 转/分钟离心 10 分钟，倒掉上清液； 干后用 100%的洒精清洗，干后加适量 TE 2、PCR 扩增 模板 DNA 的浓度大约 25ng/ul，扩增反应体系为 20ul。具体如下： Sterile ddH 2 O PCR Buffer 11ul 3ul 网站： Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 地址：山东省崂山区山东头路 58 号盛和大厦 2-1706 青岛昊航科贸有限公司 dNTP-mix Primer1 Primer2 Taq polymerase DNA 1ul 1ul 0.5ul(2U/L 3ul 0.5ul PCR 扩增程序为： （2h30min） 预变性：94，5 分钟； 变 退 延 循 性：94，40 秒； 火：55 40 秒； 伸：72，1 分钟； 环：从 2 到 4 共 38 个循环； 72下最后延伸 5 分钟；4 5min,扩增产物置于 4的冰箱保存。 3、扩增产物的电泳分离 制胶灌胶上样电泳 扩增产物用 8%的聚丙烯酰胺变性胶电泳分离，步骤如下： 准备电极液（1×TBE） ； 将梳子拨出，并迅速用电极液冲洗胶面； 不预电泳； 点样，电泳 220v； 拆板，并及时将内板、边条及梳子洗净。 4、凝胶染色 固定：10%醋酸，5 分钟； 染色：10 分钟； 漂洗：dH 2 O，510 秒； Na 2 S 2 O 3 1min 显色：甲醛- NaOH,直到满意为止； 漂洗：dH2O，2 分钟。 5、自封带封胶，读带标记，数码照相摄像，室温风干。 Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 地址：山东省崂山区山东头路 58 号盛和大厦 2-1706 网站： -