western的操作步骤.doc

Western Blot操作全过程一， 收蛋白a（如果要收集死细胞）1. 取冰，将4°C离心机提前降温。2. 将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。3. 弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。4. 视细胞量的多少加入细胞裂解液。（1×Cell Lysis Buffer：PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。PMSF常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。）5. 冰上裂解15min，将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。6. 小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。如：100L。7. 将收集好的蛋白保存与20°C。（可长期保存）b （如果不收集死细胞）1弃上清，孔板PBS洗1-2遍，吸尽PBS。在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。（同上）2冰上裂解15min，用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。（不同的孔不能用同一个刮子，刮前用水冲洗，擦干。）3将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。4小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。5将收集好的蛋白保存与20°C。（可长期保存）二， 测蛋白浓度BCA法（或者按照自己的试剂盒说明操作）1. 需96孔板，测蛋白浓度的A液，B液，标准蛋白，要测的样品蛋白。2. 按要测的样品蛋白的数量来配AB液，每孔需AB混合液80l（A：B=50：1）。例：有5个样品，加上5个标准蛋白和空白对照。共有11个孔。则A液取11×80=880l，B液取880÷50=17.6两液混匀，加入96孔板，每孔80l。然后加入标准蛋白及样品蛋白4l。（标准蛋白先配好浓度125，250，500，1000，2000）3. 将孔板放入37°C温箱孵育30min。4. 用酶标仪测蛋白浓度。5. 记下蛋白浓度，根据要上样的g量算出l量。例：蛋白浓度为1000，需上样15g。则需上样15÷1000=？上样量不超过20l。三， 配胶1. 将薄板和厚板用洁净的布擦干净，对齐，夹好。（板必须擦干净，下端对齐，否则容易漏胶。）2. 配分离胶，根据要跑的蛋白分子量，配相应浓度的胶。3. 快速将分离胶加入薄厚板之间，不能太满，留出浓缩胶的部分。(浓缩胶高度大约1CM)4. 在分离胶上灌水，要缓慢，为了让胶凝的更好。5. 30分钟左右，分离胶凝了，将水倒掉，滤纸吸干，找好梳子。制浓缩胶。6. 灌胶，快速插入相应的梳子。7. 约15min胶可以凝固。四， 煮蛋白1. 煮蛋白前将蛋白中加入6×SDS+DTT(即上样缓冲液)。例样品蛋白共有100l，则需加100÷5=20l 6×SDS+DTT。混匀。（加有DTT的SDS应-20°C保存。DTT应-20°C保存。SDS：DTT=9：1）。2. 将蛋白沸水煮10min。煮过的蛋白在两周内有效。五，上样，跑胶，转膜1. 电泳巢内加入电泳液，夹好胶板。拔去梳子。2. 每孔上样量不超过20l，每块胶应上有Maker。剩余的孔里上1×SDS。3. 蛋白上样前要震荡混匀。4. 浓缩胶80V，分离胶120V。5. 转膜半干法转膜 或者湿转 自己的试验条件决定。根据分子量的大小，按照Maker的位置裁胶，根据胶的大小，剪相应大小的NC膜。（NC膜要先用甲醇活化）。六，封闭5%牛奶（TBST稀释的脱脂牛奶）室温封闭1-2h， 七，封一抗摸清抗体要用的浓度。用TBST或5%牛奶加抗体。室温1-2h，或4°C过夜。用过的抗体要回收，做记号，用的第几次。放入-20°保存。八，洗膜用TBST摇床上洗3遍，每次10min。（一抗不要摇的太剧烈）九，封二抗摸清二抗的浓度。室温45min-2h。抗体回收，做记号，用的第几次。放入-20°保存。十，洗膜用TBST摇床上洗3遍，每次10min。（二抗可以摇的稍快些）十一，发光1. 在发光板内放入干净的可以夹住NC膜的薄膜，放好已经洗好的膜。用滤纸吸干膜上的水。2. 拿齐发光板，发光液，1ml的枪及枪头（至少两根），胶片，一张滤纸，一个离心管。3. 进入暗室，反锁好门，开红灯，在离心管内配发光液，A液：B液=1：1。先A后B。切记换枪头，打开薄膜，将AB液混匀，均匀的洒在NC膜上。盖上薄膜，将多余的发光液推开，以防水多膜移动。漏出薄膜外的可用滤纸吸干。4. 关灯，看见荧光，盖上胶片。胶片盖上之前先在左上角（个人习惯）折个角，好辨认方向。5. 根据荧光强度按压几秒或几分钟。将胶片放入洗片机冲洗。6. 等片子完全洗好，可开灯。或者DAB显色需要买试剂盒。十二，扫描保留结果