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PCRPCR实验室实验室检测技术检测技术宁夏动物疾病预防控制中心宁夏动物疾病预防控制中心2011.08.04PCRPCR检测技术检测技术 一、一、 PCRPCR技术原理技术原理 DNADNA在细胞中的复制是在细胞中的复制是个比较复杂的个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：过程。参与复制的基本因素有：DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA连接酶、连接酶、DNADNA模板、由引发酶合成的模板、由引发酶合成的RNARNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pHpH、以及解开以及解开DNADNA的超螺旋及双螺旋等结构的若的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。干酶与蛋白质因子等。 PCR PCR是在试管中进行是在试管中进行DNADNA复制反应，基本原复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的理与体内相似，不同之处是耐热的TaqTaq酶取代酶取代DNADNA聚合酶，用合成的聚合酶，用合成的DNADNA引物替代引物替代RNARNA引物，引物，用加热用加热( (变性变性) )、冷却、冷却( (退火退火) )、保温、保温( (延伸延伸) )等改等改变温度的办法使变温度的办法使DNADNA得以复制，反复进行变性、得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使退火、延伸循环，就可使DNADNA无限扩增。将扩无限扩增。将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下一般都可见到照射下一般都可见到DNADNA的特异扩增条带。的特异扩增条带。二、二、PCRPCR技术工作流程及注意事项技术工作流程及注意事项 （一）（一）PCRPCR实验室的布局实验室的布局 PCRPCR只需几个只需几个DNADNA分子作模板就可大量扩增，分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量应注意防止反应体系被痕量DNADNA模板污染和交叉模板污染和交叉污染，这也是最容易造成假阳性原因之一。实验污染，这也是最容易造成假阳性原因之一。实验室布局应重点考虑避免这种污染。因此用于室布局应重点考虑避免这种污染。因此用于PCRPCR检测的实验室要进行功能区域划分，从对环境要检测的实验室要进行功能区域划分，从对环境要求的严格程度和功能上可将求的严格程度和功能上可将PCRPCR整个实验流程划整个实验流程划分为四个区域：分为四个区域： 1.1.配液区（准备区）配液区（准备区） 2.2.模板提取区模板提取区 3.PCR3.PCR扩增区扩增区 4.4.电泳区电泳区 （二）各区操作注意事项（二）各区操作注意事项下述操作在该区进行：下述操作在该区进行： 储存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液储存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。的制备。在本区的实验操作过程中，必须戴手套并经常更在本区的实验操作过程中，必须戴手套并经常更换。换。操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。的措施。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验室及其设备的使用必须有日常记录。实验室及其设备的使用必须有日常记录。 2. 2. 模板制备区模板制备区 下述操作在该区进行：下述操作在该区进行： 标本保存、核酸（标本保存、核酸（RNARNA、DNADNA）提取、贮存及其）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定加入至扩增反应管和测定RNARNA时时cDNAcDNA的合成。的合成。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。处理和灭活程序。样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法。核酸提取方法。3. 3. 扩增区扩增区下述操作在该区进行：下述操作在该区进行：DNADNA或或RNARNA扩增。扩增。不能从本区再进入任何不能从本区再进入任何“上游上游”区域，可降低区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，尽量减少在本区的为避免气溶胶所致的污染，尽量减少在本区的走动。走动。4.4.电泳区电泳区 下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，应注意实溴化乙锭、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，应注意实验人员的安全防护。验人员的安全防护。本区如采用负压或减压情况下可减少扩增产物从本本区如采用负压或减压情况下可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。区扩散至前面区域的可能性。 （三） PCR实验室设置的原则 注意：n唯一流向制度问题 ：要求物流、人流均应严格遵守1 2 3 4路线，严禁倒流。 n物品的专用与移动问题 ：移液器、吸头和离心管等为PCR专用，各区之间勿串用三、PCR操作程序n一是一是PCRPCR扩增模板的制备扩增模板的制备，也就是病原微，也就是病原微生物基因组提取生物基因组提取n二是二是PCRPCR扩增扩增，即目的基因特异扩增过程，即目的基因特异扩增过程n三是琼脂糖凝胶电泳分析三是琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯下，在紫外灯下检测基因片段检测基因片段*PCR模板的提取（一）样品的采集及前处理（一）样品的采集及前处理n活禽，建议取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子时将活禽，建议取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子时将拭子深入喉头口来回刮几次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭拭子深入喉头口来回刮几次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子时将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便。然后将拭子一子时将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便。然后将拭子一起放入盛有起放入盛有2ml PBS2ml PBS（含抗菌素）的试管，充分洗涤拭（含抗菌素）的试管，充分洗涤拭子，然后在管壁挤干液体，转入无菌离心管中备用。子，然后在管壁挤干液体，转入无菌离心管中备用。n组织脏器，取待检样品组织脏器，取待检样品0.05g0.05g于已洗净、灭菌并烘干的于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加研钵中充分研磨，加2ml PBS2ml PBS混匀，取上清转入无菌离混匀，取上清转入无菌离心管中备用。心管中备用。n血清、血浆、乳汁、精液或组织渗出液，则直接取用。血清、血浆、乳汁、精液或组织渗出液，则直接取用。 （二）提取模板（二）提取模板n提取病原微生物基因组是提取病原微生物基因组是PCRPCR操作成功关操作成功关键的一步，特别是病原键的一步，特别是病原RNARNA的提取显得非的提取显得非常重要。一般分为两步：常重要。一般分为两步： 1.1.裂解病原微生物，使病原基因组从裂解病原微生物，使病原基因组从病原体溢出。病原体溢出。 2.2.纯化病原基因组，去除蛋白质和一纯化病原基因组，去除蛋白质和一些盐类。些盐类。（三）病原微生物基因组提取注意事项（三）病原微生物基因组提取注意事项1.RNA1.RNA提取应注意提取应注意RNARNA酶（酶（RNaseRNase）污染问题，）污染问题，RNaseRNase是一种不怕热和不易降解的蛋白质，是一种不怕热和不易降解的蛋白质，而且广泛存在于我们工作环境中，对于此而且广泛存在于我们工作环境中，对于此酶污染的防治办法主要有两方面：酶污染的防治办法主要有两方面：在提在提取取RANRAN试剂中加入一些试剂中加入一些RNase RNase 抑制剂抑制剂 操操作过程中保持环境干净、密闭、戴口罩手作过程中保持环境干净、密闭、戴口罩手套操作等。套操作等。2.在病原微生物基因组提取时，由于是微在病原微生物基因组提取时，由于是微量，几乎看不见。所以当离心机离心沉量，几乎看不见。所以当离心机离心沉淀淀RNARNA和和DNADNA时要记住离心管方向，加入时要记住离心管方向，加入乙醇洗沉淀时要缓慢加入，避免冲掉已乙醇洗沉淀时要缓慢加入，避免冲掉已提取出来的模板。溶解沉淀时要沿着沉提取出来的模板。溶解沉淀时要沿着沉淀部位进行溶解。淀部位进行溶解。3.3.在病原微生物基因组提取时，应注意实在病原微生物基因组提取时，应注意实验室环境污染和操作人员安全防护。验室环境污染和操作人员安全防护。（四）实验器材必须使用PCR专用吸头试剂盒的运输和贮存试剂盒的运输和贮存nPCRPCR试剂盒在适当的贮存温度下的有效期试剂盒在适当的贮存温度下的有效期一般为一般为6 6个月个月n核酸扩增部分的试剂一般要贮存于核酸扩增部分的试剂一般要贮存于-20-20产物检测部分试剂则贮存于产物检测部分试剂则贮存于2 288。*PCR扩增（一）PCRPCR反应体系组成反应体系组成 PCR PCR缓冲液缓冲液( (含含MgMg2 2) ) 模板模板 4 4种种dNTPdNTP 引物引物 Taq Taq酶酶（二）PCR扩增程序： 扩增程序实际上是一个扩增程序实际上是一个3 3种不同温度的热种不同温度的热循环程序。包括循环程序。包括高温变性高温变性：将病原微生物基：将病原微生物基因模板因模板94 94 条件下，使得双链条件下，使得双链DNADNA分子变成单分子变成单链链DNADNA。有利于下一步的引物结合。有利于下一步的引物结合。低温退低温退火火：在：在4040至至60 60 条件下，使引物与单链条件下，使引物与单链DNADNA结合的过程。便于下一步新结合的过程。便于下一步新DNADNA链形成链形成 适温适温延伸：延伸：在在7272条件下，沿引物合成新的条件下，沿引物合成新的DNADNA链。链。 在这在这3 3个温度条件下循环个温度条件下循环3030至至3535次，可将次，可将病原微生物特定的病原微生物特定的DNADNA片段放大百万倍。片段放大百万倍。（三）PCR扩增注意事项n试剂：尽量分装，不要原瓶多次取用。试剂：尽量分装，不要原瓶多次取用。n加入模板切忌喷雾污染，在吸取液体时，加入模板切忌喷雾污染，在吸取液体时，尽量避免用力过快吸取。避免反应成分或尽量避免用力过快吸取。避免反应成分或模板喷到移液器上，污染移液器和环境。模板喷到移液器上，污染移液器和环境。所有非即用管都应盖严。加模板所有非即用管都应盖严。加模板DNADNA后应后应更换手套。更换手套。*琼脂糖凝胶电泳分析n扩增基因片段需要进行琼脂糖凝胶电泳分析，依据扩扩增基因片段需要进行琼脂糖凝胶电泳分析，依据扩增增DNADNA片段在电泳中迁移的距离判定其大小，与已知扩片段在电泳中迁移的距离判定其大小，与已知扩增基因片段相比较来判定增基因片段相比较来判定PCRPCR扩增效果。扩增效果。n在进行琼脂糖凝胶电泳分析时，一般情况下先在凝胶在进行琼脂糖凝胶电泳分析时，一般情况下先在凝胶中加中加1%1%溴化乙锭（溴化乙锭（EB)(EB)(每每100ml100ml加加10ul)10ul)然后将已经制然后将已经制备好的备好的1%-2%1%-2%琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配制）放入电琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配制）放入电泳槽内，加入待检样品，同时用分子量标准品作标记。泳槽内，加入待检样品，同时用分子量标准品作标记。待检样品进入凝胶内溴酚蓝迁移待检样品进入凝胶内溴酚蓝迁移2-3cm2-3cm后，切断电源，后，切断电源，取出凝胶在紫外灯下观察结果。取出凝胶在紫外灯下观察结果。n由于由于EBEB可与双链可与双链DNADNA形成结合物，在紫外灯下能发射荧形成结合物，在紫外灯下能发射荧光，使光，使EBEB的荧光强度增强的荧光强度增强80-10080-100倍，所以，电泳后凝倍，所以，电泳后凝胶在紫外灯下可直接观察。胶在紫外灯下可直接观察。电泳所需试剂n琼脂糖琼脂糖n溴化乙锭溴化乙锭n电泳缓冲液电泳缓冲液n上样缓冲液上样缓冲液nMackerMacker电泳槽电泳仪 凝胶成像系统PCR结果。1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）琼脂糖凝胶电泳分析注意事项n电泳上样时避免电泳上样时避免PCRPCR产物漂移到其他孔而产物漂移到其他孔而影响结果判定。影响结果判定。n用电泳缓冲液制备琼脂糖凝胶。用电泳缓冲液制备琼脂糖凝胶。n溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）为强致癌物质，必须戴）为强致癌物质，必须戴手套谨慎操作，摇动时不要外溅。手套谨慎操作，摇动时不要外溅。四、PCR检测常见问题与解决途径 n利用利用PCRPCR方法检测时，经常出现假阳性、假阴方法检测时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。尤其是假阳性和性、非特异性扩增和涂抹带。尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。为了提高检测的准确性和可靠性，成严重后果。为了提高检测的准确性和可靠性，PCRPCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。一个好的性扩增和涂抹带现象的发生。一个好的PCRPCR方方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性，尽量减少假阳性、假高的可重复性、重现性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。阴性和非特异性扩增。（一）假阳性： 造成假阳性的原因n1. 1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；污染导致标本间污染；n2. PCR2. PCR试剂的污染：主要是由于在试剂的污染：主要是由于在PCRPCR试剂配制过程中，由于加试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCRPCR核酸模板污染。核酸模板污染。n3. PCR3. PCR扩增产物污染：这是扩增产物污染：这是PCRPCR反应中最主要最常见的污染问题。反应中最主要最常见的污染问题。因为因为PCRPCR产物拷贝量大产物拷贝量大( (一般为一般为10131013拷贝拷贝/ml)/ml)，远远高于，远远高于PCRPCR检测检测数个拷贝的极限，所以极微量的数个拷贝的极限，所以极微量的PCRPCR产物污染，就可形成假阳性。产物污染，就可形成假阳性。 n4. 4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩气溶胶污染：在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶，在操擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含4800048000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。假阳性问题的试验控制n在每次在每次PCRPCR检测时，一定设立阴性对照样品和检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明对照样品检测为阳性时，表明DNADNA提取（提取（RNARNA提提取、取、RNARNA反转录）、反转录）、DNADNA扩增和电泳鉴定工作体扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。成立。（二）假阴性 如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。但这里应注意，许多国产但这里应注意，许多国产PCRPCR试剂盒中阳性对试剂盒中阳性对照采用质粒照采用质粒DNADNA，和标本相比来说，不需纯化，和标本相比来说，不需纯化提取核酸的步骤，因此，如果在标本核酸纯化提取核酸的步骤，因此，如果在标本核酸纯化提取步骤有问题，即使阳性对照均呈阳性，标提取步骤有问题，即使阳性对照均呈阳性，标本检测中还可能有假阴性。本检测中还可能有假阴性。造成假阴性原因：1 1.仪器因素仪器因素2.2.试剂质量问题试剂质量问题3.3.核酸模板问题核酸模板问题：模板中含有杂蛋白质；模板中含模板中含有杂蛋白质；模板中含有有 Taq Taq 酶抑制剂；模板核酸变性不彻底等。酶抑制剂；模板核酸变性不彻底等。4.4.操作人员素质问题操作人员素质问题：PCRPCR实验的环节很多，而实验的环节很多，而且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误等等都能造成结剂、离心不充分、循环参数设计错误等等都能造成结果的假阴性。果的假阴性。n假阴性解决方案假阴性解决方案1.1.检查检查PCRPCR试剂是否失效试剂是否失效2.2.选择与优化样品选择与优化样品DNADNA提取方法，验证提取方法，验证DNADNA提取试剂是否失效。提取试剂是否失效。（三）污染处理 1. 1. 提取时所用的提取时所用的EPEP管、玻璃等器皿全部都要管、玻璃等器皿全部都要用用0.1%DEPC0.1%DEPC水浸泡。然后烘干，高压灭菌，再水浸泡。然后烘干，高压灭菌，再烘干。烘干。 2. 2. 用用DEPCDEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。水洗过后当然不能用双蒸水洗了。 3. 3. 玻璃器皿干烤：玻璃器皿干烤：180 180 ，8 8小时或更长时间；小时或更长时间；小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外，铁小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。 4. 4. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。验过程中手套要勤换。 谢谢 谢！谢！