大肠杆菌感受态细胞的制备与转化ppt课件.ppt

实验实验 七七大肠杆菌感受态细胞的大肠杆菌感受态细胞的制备与转化制备与转化1、学习掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法2、学习和掌握热激法转化大肠杆菌的原理和方法3、把实验六连接反应产物进行转化实验 1）相关名词概念 将质粒导入大肠杆菌或其它细胞内的过程叫作转化。 与噬菌体不同，质粒本身不具备感染细胞的能力。为了使细胞能吸收外来DNA，必须改变其细胞生理状态，使之具有很高的接收外源DNA的能力，这种具有接收外源DNA能力的细胞叫感受态细胞。2 ） CaCl2- 热激法转化原理 CaCl2能改变细胞膜的通透性，大肠杆菌经低渗CaCl2溶液致敏处理，就变成高效的感受态细胞；感受态细胞与质粒混匀于0时，混合物中的DNA形成抗DNase羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，再经42 短时热激时进入细胞内实现转化，利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落。 1、材料、材料 菌株：E.coli TOP10 质粒：pBI121-chs(实验六连接反应产物) 2、试剂、试剂 LB液体培养基、LB/Amp(100ug/mL)固体培养皿、灭菌0.1mol/L CaCl2、灭菌去离子水 （一）（一） CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞法制备大肠杆菌感受态细胞1）挑取纯化的大肠杆菌TOP10单菌落接种于盛有5 mL LB液体培养基的小三角瓶里，37，180rpm振荡培养过夜；2）取1 mL培养菌液接入100 mL液体培养基中，37 180rpm振荡培养至OD600为0.5-0.6，冰浴15min； 3）将菌液分别移入1.5mL无菌EP管中，4，4000rpm离心5min，弃上清，沉淀用1mL预冷的0.1M CaCl2 （过滤灭菌）悬浮，用枪头轻轻混匀，冰浴15 min；4）4，4000rpm离心10min，弃上清，沉淀再加200L预冷的0.1M CaCl2，轻轻重悬，冰上放置0.55小时后，即可用于转化；或每管加灭菌甘油至终浓度15%，混匀，液氮冷激后置于-70冰箱保存。 （二）热激法转化（二）热激法转化E.coli TOP10 1）将连接产物10L转移至装有200L感受态细胞的1.5mL 离心管中，轻轻混匀（并设置1管负对照：200L感受态细胞悬液+10L无菌双蒸水）； 2）冰浴30min后，42热激90sec, 冰浴2min； 3）加入800L无抗生素的LB液体培养基，在37小于180rpm下振荡培养0.51小时； 4）复苏后的菌液在4000rpm下常温离心3min，吸取上清液900L留约100L 菌液在离心管底部，并用移液枪轻轻吹打重悬； 5）用移液枪将重悬菌液移入带有相应抗生素（Amp:100g/mL,平板表面涂有20mg/mL的X-gal 40L和20mg/mL的IPTG 40L）的37保温的LB固体培养基平板上，用灭菌的涂布器涂布均匀； 6）将平板倒置于37恒温箱中培养1218小时。