2022年分子生物学实验讲义 .pdf

实验讲义课程名称：分子生物学实验课程性质：专业课课程类型：必修课专业： 生物工程、生物技术、生物科学学时： 80 、32 生物科学与工程学院分子生物学实验室名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 30 页 - - - - - - - - - 目录一、课程说明二、实验要求二、实验内容实验一实验室主要规定和分子生物学实验常用仪器使用实验二碱裂解法小量提取质粒DNA 实验三感受态细胞的制备及转化实验四基因组 DNA的提取实验五特异性片段 PCR 的扩增实验六外源基因在大肠杆菌中的诱导表达实验七利用 ITS 序列鉴定真菌实验八外源基因在大肠杆菌中诱导表达的条件优化名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 30 页 - - - - - - - - - 一、课程说明分子生物学实验课程是一门年轻的课程。90 年代初期，随着分子生物学日新月异的发展，分子生物学实验技术已成为生命科学各学科重要的研究工具。由于需要较高的经费投入，师资不足等原因，国内高校中还没有分子生物学实验课程。高等学校生命科学各专业的学生要适应时代的发展，除了需要学习分子生物学理论和分子生物学技术的基本知识以外，还必须系统地培养学生在分子生物学方面的技术素养与动手能力，我们在2008年修订本科培养方案时将分子生物学实验作为一门独立的课程，并作为生命科学各专业学生的专业必修课。单独开设分子生物学实验这门课后，在原有的基础上又增加了新的分子生物学技术和实验内容。学生通过此课程既学到了适应时代前沿的技术，又大大增加了他们的实践和动手能力。我们为本课程设了学生实验设计，安排一到两个较新的和系统的实验题目，由学生设计、学生自己完成实验（教师只是参与指导和讨论）。主要目的是通过学生自己设计、自己完成实验 ,把前面学到的理论、 技术融会贯通地用到实际课题中去，使理论与实践更好的结合，提高学生创新性思维和独立分析、解决问题的综合能力。该课程以本学科的基础实验技术为主，开设了8 个实验，分为验证、综合和设计三个类型，目的在于训练学生基本技能、实验动手能力、综合分析能力和创新能力；基本概括了分子生物学的主要技术，实验体系较为完整，符合我院实际。教学安排中根据三个专业培养方案的课程设置进行实验项目选择，满足各专业对本课程的具体要求。对于验证性实验，教师可以直接根据学生所做的实验报告评判其实验成绩。综合性、设计性实验由于所涉及的知识点数量不同，综合运用的效果不同，设计方案是否得当，步骤是否简易可行，实验的成本、效率是否令人满意等等，都不能一概而论，因此需要教师结合各方面进行综合的评定。二、实验要求1. 实验前、中、后要求1.1 实验前了解实验的目的，理解实验的原理，熟悉操作步骤，清楚实验的注意事项。结合实验，查阅一定相关资料，掌握理论知识，提高实验课的效果。预测本次实验结果，对预测的结果尽可能地做出合理的解释。估计本次实验可能发生的问题，并思考解决问题的应急措施。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 30 页 - - - - - - - - - 1.2 实验中按要求正确使用仪器和器械，按实验步骤有序进行实验。认真观察和纪录实验结果，并做必要的标记、文字说明；实验过程中还要思考会出现什么样的结果？为什么会有这样的结果？这些结果有何意义？若出现非预期结果，还应分析其原因，尽可能地及时解决。实验中要有耐心，必须等前一步实验完成到位后，才能进行下一步操作，注意观察实验的变化现象。1.3 实验后实验结束后要及时关闭仪器和设备的电源；按规定整理实验器具和处理废弃物。及时整理实验纪录，分析实验结果，得出实验结论。认真撰写实验报告，按时交给教师批阅。2. 实验课纪律要求2.1 上课时间提前 5 分钟进入实验室；不迟到、不早退，无故旷课累计3 次没成绩。2.2 上课时需穿实验服，不许在实验室内吃东西，不穿拖鞋进实验室。2.3 实验课期间不许打闹、闲聊等，不大声喧哗，不中途缺席。2.4 公用试剂不得污染！公用台上公用试剂不得私自拿到自己实验台上。2.5 不得私自拿走或乱放别人的实验物品、实验产品。2.6 不得擅自使用实验室中非本实验仪器、试剂。2.7 实验废液不随便倾倒，随时保持实验台的整洁；2.8 实验前按仪器性能与要求，进行仪器预热；2.9 实验完成后检查电源插座，用完仪器后必须复位，清洁干净仪器，摆放整齐；每组实验物品齐全，需教师验收，移液枪量程要归位，发现问题及时报修。2.10 每位同学负责自己实验台面和柜体的卫生，值日生负责公用实验台、地面等处卫生。2.11 每次轮到打扫卫生的小组，要认真做好值日工作，离开实验室须向教师声明。2.12 同学与老师之间、同学与同学之间一定要互相协作配合，保持公用房间卫生，注意门窗水电的安全。2.13 遵守实验室其它规则。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 30 页 - - - - - - - - - 三、分子生物学实验内容验证型实验（实验一、二）实验一、实验室主要规定和分子生物学实验常用仪器使用一、 实验目的1. 熟悉分子生物学实验室主要规定2. 了解本实验课的常用仪器、设备、耗材3. 掌握本实验课所用仪器的功能和使用方法二、 实验内容（生物科学专业不讲的内容）1. 实验室主要规定1.1 实验室防火安全规定实验室内严禁吸烟，严禁私人使用电炉取暖、烧火、做饭。严禁在实验室内存放剧毒、易燃、易爆物品，上述物品应放在药品库内，由专人保管。电炉、电烘箱要放在不燃的材料基础上，严格掌握烘烤温度，用完要立即切断电源。使用电炉、酒精灯等要远离化学易燃物品。实验室使用有毒物质或进行能产生有危害气体的实验，应在通风橱内进行。做易燃液体的蒸馏、回收、回流、提取操作时，要由专人在专用设施内进行，周围不得放置化学易燃危险物品。实验室配备相应的消防器材，各分室指派专人保管。下班或节假日前要进行安全检查，切断电源、火源，关窗、锁门。1.2 实验室清洁卫生规定实验室是教学和科研的重地，为了保证正常教学、科研工作的顺利进行，为教师学生创造良好的工作和学习的环境，特规定：实验室家具、仪器设备要摆放整齐，布局合理。桌面、仪器要无灰尘。地面无尘土、无积水、无纸屑、烟头等垃圾。墙面、门窗要清洁，无积灰，无蛛网等。在实验室不存放与实验室无关的杂物。实验室通风、采光、照明设施要完好。实验室工作人员、 教师和学生在实验室工作或学习，必须保持实验室室内外的清洁卫生，不准抽烟， 不准随地吐痰， 不准乱抛纸屑杂物。 下班或下课时要整理好仪器，摆放好桌椅，打扫桌面、地面和门窗的清洁卫生。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 30 页 - - - - - - - - - 上实验时要检查卫生，如果卫生不合要求，要先整理卫生。全实验室人员共同努力，把实验室建设成文明实验室。1.3 实验室关于损坏仪器设备、设施赔偿和违章处罚办法责任事故处理制度： 由于下列原因发生责任事故， 造成仪器设备、 实验室设施损坏的，责任人应按规定赔偿：不听从指挥，不按技术操作规程或规定要求操作。不按制度又未经批准，擅自动、用、拆、改仪器设备。尚未掌握操作技术或了解性能及使用方法，轻率动用仪器设备。未经批准，擅自将仪器设备携出本室外造成损坏或丢失。工作失职，指导错误，纠正不及时或保管不当造成损坏或丢失。与生活密切相关，属个人保管、使用的便携仪器造成丢失。其它由于不遵守规章制度造成的损坏或丢失。非责任事故处理制度：由于下列客观原因，造成仪器设备、实验室设施损坏的，经过鉴定和有关责任人证实，可不赔偿：仪器设备本身的质量问题（如：缺陷、老化等），造成正常使用中的损坏。因实验操作本身的特殊性引起的损坏，确实难以避免的经过批准。由于其他的客观原因（如突然停电、停水、电源故障等）造成意外损坏、损失。2. 分子生物学实验常用设备、仪器介绍及用途2.1 温度控制设备2.1.1冰箱类 : 根据药品、试剂及多种生物制剂保存的需要，必须具备不同控温级别的冰箱， 最常使用的有：4、-20、 -80冰箱。 4 适合储存某些溶液、 试剂、药品等； -20 适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA 、蛋白质样品等； -80 适合某些长期低温保存的样品、纯化的样品、特殊的低温处理消化液等的保存；0-10的冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。2.1.2液氮罐：有些实验材料、某些器官组织、细胞株、菌株及纯化的样品等，要求速冻和长期保存在超低温环境下，就需要一个液氮罐（-196） ，具有经济、省力和较好地保持细胞生物学特性的优点。2.1.3培养箱类： 37恒温箱用于细菌的固体培养和细胞培养； CO2培养箱适用于培养各种细胞，可恒定地提供一定量的CO2（通常 5% ） ，用来维持培养液的酸度（pH值） ；37恒温空气摇床可进行液体状态下的细菌培养。2.1.4 水浴锅类：用于保温。 25-100 水浴摇床可用于分子杂交试验、各种生物化学酶反名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 30 页 - - - - - - - - - 应等试验的保温。 25-100 水浴箱用于常规试验。2.1.5烘箱类：用于烘干实验器皿，有些需要温度高些，有些需要温度低些。用于RNA方面的实验用具，需要在250烤箱中烘干，有些塑料用具只能42-45的烤箱中进行烘干。2.2 净化水：许多分子生物学实验需要纯度很高的水。2.2.1 蒸馏水：将普通水加热到沸腾使之汽化，再冷却汽化水， 变为液体的水， 即成为（一次）蒸馏水。要得到更纯的水，可在一次蒸馏水中加入碱性高锰酸钾溶液，除去有机物和二氧化碳；加入非挥发性的酸（硫酸或磷酸），使氨成为不挥发的铵盐。由于玻璃中含有少量能溶于水的组分，因此进行二次或多次蒸馏时，要使用石英蒸馏器皿，才能得到很纯的水，所得纯水应保存在石英或银制容器内。 更高的要求，可能还要三蒸水、 四蒸水 .。2.2.2去离子水：要将水先通过石英砂过滤颗粒较粗的杂质，再通过阳离子交换树脂（常用的为苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂），则水中的阳离子被树脂所吸收，树脂上的阳离子 H+被置换到水中，并和水中的阳离子组成相应的无机酸；含此种无机酸的水再通过阴离子交换树脂（常用的为苯乙烯型强碱性阴离子）OH被置换到水中，并和水中的H+结合成水，即得到去离子水。2.2.3 超纯水：应用蒸馏、去离子化、反渗透技术或其它适当的超临界精细技术生产出来的水，这种水中除了水分子外，几乎没有什么杂质，更没有细菌、病毒、含氯二恶英等有机物，当然也没有人体所需的矿物质微量元素，一般不可直接饮用，对身体有害，会析出人体中很多离子。用于 PCR 、氨基酸分析、 DNA 测序、酶反应、组织和细胞培养等。2.3 灭菌设备：分子生物学所用大部分试剂和实验用具都应严格灭菌。2.3.1蒸汽消毒锅：用于小批量物品的随时消毒。大批实验物品、试剂、培养基可使用大型消毒器定时进行消毒2.3.2 紫外线、 75% 乙醇 、0.1% SDS （消毒剂） ：一些不耐高压、高温物品可用紫外线照射或乙醇和SDS浸泡。 紫外线照射使用方便，但灭菌效果与距离有关，且产生臭氧污染环境，常用于无菌室，超净台和塑料用具的消毒。2.3.3 滤器滤膜：用于不耐高温或高压的试剂的除菌。2.4 计量系统2.4.1 称量仪器：台秤、托盘天平、钮力摆动天平、精密电子分析天平。2.4.2液体体积的度量器：精：量筒、移液管、微量移液器；粗：刻度试管、烧杯、锥形瓶。可调式微量移液器的使用方法：适用水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液；按到第一档，垂直进入液面几毫米；缓慢松开控制按钮，否则液体进入吸头过速会导致液体倒名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 30 页 - - - - - - - - - 吸人移液器内部吸人体积减少；打出液体时贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿1s 后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。黏稠或易挥发液体的移取： 移取黏稠或易挥发的液体时， 很容易导致较大的体积误差。为了提高准确性，应采取以下方法即移液前先用液体预湿吸头内部，吸液或排出液体时最好多停留几秒；采用反相移液法：吸液时按到第二档，慢慢松开控制按钮，打液时按到第二档，部分液体残留在吸头内。可调式微量移液器常见的错误操作：吸液时，移液器本身倾斜，导致移液不准确( 应该垂直吸液，慢吸慢放 ) ；装配吸头时，用力过猛，导致吸头难以脱卸( 无需用力过猛，选择与移液器匹配的吸头 ) ；平放带有残余液体吸头的移液器(应将移液器挂在移液器架上) ；用大量程的移液器移取小体积样品( 应该选择合适量程范围的移液器) ；直接按到第二档吸液(应该按照上述标准方法操作) ；使用丙酮或强腐蚀性的液体清洗移液器(应该参照正确清洗方法操作 ) 。2.4.3 pH值测量： pH 计是测定溶液中H+ 的直接电位的仪器，主要通过一对电极，在不同的 pH溶液中产生不同的电动势，用pH值表示出来。分子生物学大部分实验试剂要求严格的 pH值，需精确度高（小数点后两位） ，要用精密 pH计；pH试纸：适用于培养液、酚饱和液、缓冲液或其它试剂溶液的pH值的粗略估计。2.5 分光光度计：是利用物质在可见光和紫外线区域中的吸收光谱来鉴定该物质的性质及其含量的一种仪器。它是由光源、单色器、吸收池、接收器、测量仪表或显示屏幕所组成，以光密度 (OD)值表示。 OD 值是许多溶液中溶质定量的方便指标之一，通过分光光度计光源所产生的单色光而测定某一溶液对该单色光的吸收值，利用它可进行核酸溶液的定量和纯度的初步判断。2.6 离心机：离心技术是研究生物的结构和功能中不可缺少的一种物理技术手段。因为各种物质在沉淀系数、浮力、和质量等方面有差异，可利用强大的离心力场，使其分离、纯化和浓缩。目前各种离心机的样品处理量从少于0.05ml 到几升。离心技术应用广泛，包括收集和分离细胞、细胞器和生物大分子等。据其转速的不同，可分为以下几种类型：2.6.1 普通离心机：转速小于10000 r/min 。医用或台式离心机：是离心机中最简单而廉价的，最常用于收集快速沉降系数的物质，如红细胞、粗大的沉淀物、酵母菌和细菌等。低速冷冻离心机：主要用于细胞、细胞核、细胞膜和细菌的沉淀和收集等。2.6.2 高速离心机：转速10000-30000 r/min ，有冷冻和常温两种，多用于制备和收集微生物、细胞碎片、细胞、大的细胞器、硫酸铵沉淀物以及免疫沉淀物等。2.6.3 超速离心机：转速大于30000 r/min 。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 30 页 - - - - - - - - - 2.7 超净工作台：是一种提供局部洁净度的设备。其原理是鼓风机驱动空气，经过低、中效的过滤器后，通过工作台面，使实验操作区域成为无菌的环境，装有紫外灯、照明灯。超净台按气流方向的不同大致有几种类型2.7.1侧流式：净化后气流，从左侧或右侧通过工作台面，流向对侧，或者从上往下或从下往上流向对侧，它们都能形成气流屏障而保障台面无菌。缺点：在净化气流和外边气体交界处，因气体的流向而出现负压，使少量的未净化气体混入，而造成污染。2.7.2外流式：气流面向操作人员的方向流动，从而保证外面气体不能混入。缺点：在进行有害物质实验时，对操作人员不利，但可采用有机玻璃把上半部分遮挡起来，使气流往下方流出。2.8 电泳系统：电泳是检测、鉴定核酸和蛋白质等生物大分子的纯度、含量及描述其特征的重要工具，也是分离、纯化、回收和浓缩样品的方法之一。2.8.1电泳装置的组成：电源装置即电源需经稳流通过稳压器，既能提供稳定的直流电，又能输出稳定的电压。电泳槽装置有水平式电泳槽、垂直式电泳槽，前者一般分为微型电泳槽和大号水平式电泳槽，后者分垂直平板电泳槽和圆柱形电泳槽。2.8.2安装方法：首先确定仪器电源开关应处于关闭状态。其次连接电源线，确定电源插座是否有接地保护。再次将黑红两种颜色的电极线对应插入仪器输出插口，并与电泳槽相对应插口连接好（如果发现电极插头与插口之间接触较松，可以用小改锥将插头的簧片向外拨一下）。第四确定电泳槽中的试剂配制是否符合要求。第五用电压调节旋钮或电流调节旋钮调到所需电压或电流。如果不熟悉如何预置电压电流， 可以先确定是恒压输出，还是恒流输出。如果是恒流输出，则将电流调节为0，将电压调至最大，然后开机，此时缓缓调节电流调节旋钮，直到所需电流值。如果是恒压输出，则将电压调为0，将电流调为最大，然后开机，缓缓调节电压旋钮至所需电压值。注意，电源在任何情况下只能稳定一种参数（电压或电流），电压电流之间的关系符合欧姆定律。第六常用电泳仪一般均有两组并联输出插口， 可以同时接两个电泳槽， 但要求这两组电流之和不超过仪器的最大值。此时最好采用稳压输出，以减少两槽之间的相互影响。第八如发现只有电压显示而电流输出为零，应检查输出端子到电泳槽之间是否断路。第九使用中发现异常情况应立即关机，如果是仪器故障，应请维修人负检。2.9 PCR 仪：也称 DNA 热循环仪、基因扩增仪，它是使一对寡核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数百万倍的靶序列DNA片段，它的每一循环包括在三种不同温度进行的DNA变性，引物复性， DNA 聚合酶催化的延伸反应三个过程。2.9.1 PCR 基因扩增仪使用方法：首先准备好反应管；其次打开机盖，将反应管平稳、端名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 30 页 - - - - - - - - - 正地置入，盖好机盖； 再次打开电源开关， 按照机器屏幕显示的提示设定程序。用 Proceed键起动扩增， 结束时出现“ Complete”，待风机停止工作， 关闭电源，取出样品，盖好 PCR基因扩增仪护套。2.9.2 PCR基因扩增仪维护注意事项：使用 PCR仪式要严格注意本机的使用环境条件和对电源的要求；打开PCR仪机盖开关要轻，防止损坏盖锁；PCR基因扩增仪工作时严禁打开机盖；要定期用肥皂水清洗仪器的样品槽，不能使用强碱， 高浓度酒精和有机溶液擦洗；产品出现故障时要及时请专业的维修人员或厂家的维修人员维修。2.10 凝胶成像分析系统 : 对电泳后含溴乙锭（ EB ）核酸样品的观察分析。观察琼脂糖凝胶中DNA 最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以嵌入 DNA 堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA 的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5 个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA 结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。 DNA吸收 254nm 处的紫外辐射并传递给染料， 而被结合的染料本身吸收302nm和 366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭 -DN复合物的荧光产率比没有结合DNA 的染料高出 20-30 倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（ 0.5ug/ml ）时，可以检测到少至10ng 的 DNA 条带。溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA 或 RNA ） 。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链DNA 或 RNA 染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。2.11 干燥设备2.11.1真空加热干燥箱：用于干燥核酸杂交实验膜（核酸在硝酸纤维素膜和尼龙膜上固定） 。2.11.2 电泳凝胶干燥箱： 电泳后的凝胶进行脱水干燥的设备，一般将凝胶放置在玻璃纸上进行干燥，干燥后的凝胶易于保存。2.11.3 液氮冷冻：适用于活性蛋白质样品的干燥与结晶。2.11.4 真空泵：许多实验都需要抽真空。如：乙醇沉淀后核酸样品的干燥，电泳凝胶的干燥等。2.12 其它2.12.1 微波炉：便于一些溶液的快速加热和定温加热，电泳琼脂糖凝胶配制、溶化等。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 30 页 - - - - - - - - - 2.12.2 制冰机：产生碎冰，提供低温环境，保护生物样品活性，减少核酸酶或蛋白酶对样品的水解。2.12.3 层析（色谱）柜：层析是一种分离多组分混合物的有效物理方法，需要在低温环境下进行。2.12.4 真空印记系统、 DNA 合成/ 测序仪：这些都是对核酸进行深入研究的必备仪器。2.12.5 磁力搅拌器、多角度旋转混匀器、快速振荡混合器：用于样品混合均匀。2.12.6 组织匀浆器、超声破碎器：破碎生物细胞或组织。2.12.7 通风橱：许多实验用试剂会产生挥发性有害气体，这些实验应当在通风橱内进行，以保护实验人员安全。 。2.12.8 Tip头、Eppendorf 管：对一些要求严格的实验，如RNA 的提取、保存等操作，应使用新的消毒 tip头与 Eppendorf 管。三、思考题1. 可调式微量移液器的使用方法？使用该移液器的注意事项？2. 分子生物学实验室的常规仪器设备有哪几大类？简单说明。3. 蒸馏水与去离子水的区别？PCR 实验需要哪种纯度的水？实验二碱裂解法小量提取质粒DNA 一、实验目的1. 掌握碱裂解法提取质粒原理及方法2. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法二、实验原理碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。 Escherichia coli ( E. coli) 染色体约 4700Kb ，SDS是一种阴离子表面活性剂，它和 NaOH 共同作用既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性， SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂， 从而使质粒 DNA 以及基因组 DNA从细胞中同时释放出来，基因组 DNA断裂为线性双链片段，而质粒DNA仍为超螺旋，释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH ）环境，就会变性，基因组DNA 完全变性，而质粒DNA只有部分变性。然后用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA为小分子，两条互补链复性迅速而准确，而线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开，难以复性，它们缠绕形成网状结构，与不稳定的大分子RNA ，蛋白质 -SDS复合物等通过离心沉淀而被除去。再通过苯酚、氯仿名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 30 页 - - - - - - - - - 等抽提蛋白， 2 倍体积无水乙醇或0.6 倍体积异丙醇沉淀质粒DNA ，70酒精洗后，干燥，用无菌的双蒸水或TE溶解质粒， 20保存。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下， DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同, 但构型不同的DNA分子。质粒有3 种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒 DNA(covalently closed circular DNA，简称 CCCDNA)，开环质粒 DNA ，即共价闭合环状质粒 DNA 的 1 条链断裂，（open circular DNA, 简称 OCDNA）, 线状质粒 DNA ，即共价闭合环状质粒DNA的 2 条链发生断裂，（linear DNA ，简称 L DNA ） 。这 3 种构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3 条带，超螺旋质粒DNA 泳动最快，其次为线状DNA ，开环质粒DNA 。但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，有时可能会出现相反的情况。三、实验仪器、材料和试剂1. 仪器、用具：恒温培养箱，恒温摇床，台式离心机，漩涡振荡器，高压灭菌锅，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像系统，1.5mL离心管，移液器，枪头，一次性手套。2. 材料：含 pUC19质粒的大肠杆菌3. 试剂：3.1 溶液 I ：成分：葡萄糖 50mmo1 L （增加粘度，减少机械剪力破坏）EDTA （pH8.0） 10mmolL（螯合金属离子，抑制DNase ）Tris HCl（pH8.0） 25mmol L（调 pH）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 30 页 - - - - - - - - - 可在使用前加入 RNase至终浓度 0.8mg/mL。200mL溶液 I 配法：葡萄糖 1.98g 1M EDTA （pH8.0） 20mL 1M Tris HCl（pH 8.0 ） 50mL 水定容至 200mL ，在 10l 磅(6.895 104Pa) 高压下蒸气灭菌 15 分钟，贮存于 4。500mL 1M Tris （pH8.0）配法：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris ）60.5g，先用 400mL水溶解，再加入浓 HCl 约 21mL ，定容，待冷却后再调pH值。500mL 1M EDTA （pH 8.0 ）配法：称取乙二胺四乙酸钠盐（Na2EDTA 2H2O ） 186.1g ，先用400mL水溶解，再加入 NaOH 约 5g，定容，再调 pH。3.2 溶液 II ： （现配）成分： 0.2mo1/L NaOH （DNA 变性，裂解细胞）1 SDS （破坏细胞膜、核膜，蛋白质变性形成复合物沉淀）100mL 0.4M NaOH 配法： 称取 NaOH1.6g ，小心缓慢加入 90ml 水中，溶解，定容100mL 。100mL 2SDS 配法： 称取十二烷基磺酸钠（ SDS ）2g，水溶解、定容 100mL 。3.3 溶液 III ： （3M K+，5M Ac-,pH 4.8 的高盐溶液）KAc 3M（K+与 SDS 形成难溶性盐，与蛋白质形成沉淀）冰醋酸 5M（调 pH ）200mL溶液 III配法：KAc 58.8g 冰醋酸 23mL H2O 定容至 200mL 3.4 50 倍体积的 TAE贮存液 (50TAE)pH 8.5： Tris 242 g 冰醋酸 57.1 mL Na2EDTA 2H2O 37.2 g H2O 定容至 1000mL 3.5 6 凝胶加样缓冲液：溴酚蓝 0.25 蔗糖 40 （W/V ）3.6 溴化乙锭溶液 (EB) 10mg mL避光保存，工作浓度0.5mg/L 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 13 页，共 30 页 - - - - - - - - - 3.7 20 g/mL胰 RNA 酶：将 RNA 酶溶于 10mmol/L Tris ?HCl(pH8.0) 、15mmol/L NaCl 中，配成的相应浓度，于100加热 15min，缓慢冷却至室温，保存于-20。3.8 琼脂糖、无水乙醇、 Tris 饱和酚、酚 / 氯仿/ 异戊醇（ 25/24/1 ） 、70乙醇、双蒸水3.9 DNA 分子量标准物3.10 LB （Luria-Bertani）培养基：配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨 (bacto-tryptone) 10g 酵母提取物 (bacto-yeast extract) 5g NaCl 10g 蒸馏水 1000mL 摇动容器直至溶质完全溶解， 用 Na0H调节 pH至 7.0 ， 固体培养基加入琼脂6g/L,121 湿热灭菌 20min。四、实验方法与步骤1. 将 2 mL含相应抗生素的LB液体培养基加入试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌单菌落， 37振荡培养过夜，取10L 培养液加入 100ml LB 液体培养基中， 37振荡培养过夜。2. 取 1.2mL 培养物倒入微量 1.5mL 离心管中， 4000 r/min 离心 1 min，弃上清，吸尽残液，使细胞沉淀尽可能干燥（如果菌体量少，可重复此步骤23 次） 。3. 加入 100L 溶液，漩涡振荡器震荡混匀。4. 加新鲜配制200 L 溶液 ，盖紧管盖，轻轻颠倒数次混匀，将离心管放冰上5 min（打开管口可见鼻涕样粘稠状） 。5. 加入冰上预冷 150L 溶液 ，盖紧管口，轻轻颠倒数次使混匀，冰上放置5 min （可见絮状沉淀）。6.12000 r/min ,离心 10 min ，将上清转至另一离心管中。 。7. 加入等体积 Tris 饱和酚（约 500L） ，反复混匀，室温放置10 min ，12000 r/min ，离心 10 min ，将上清转移到另一离心管中。8. 加入等体积酚氯仿：异戊醇（约400L） ，反复混匀，室温放置 10 min，12000 r/min ，离心 10 min ，将上清转移到另一离心管中。9. 加入 2 倍体积无水乙醇（约800L） ，混匀后，室温放置5-10 min ，12000 r/min离心5 min ，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体（可见半透明沉淀于管底）。10. 轻轻加入 500L 70% 乙醇，洗涤质粒DNA 沉淀， 12000 r/min离心 5 min ，倒去上清名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 14 页，共 30 页 - - - - - - - - - 液，真空抽干或冷风吹风干燥（质量高的DNA ，可见无色透明于管底） 。11. 加 20L 双蒸水，使 DNA 完全溶解， 加入 5L 20g/ml 的胰 RNA 酶，37保温 30min，取 5L 电泳检测，其余 20保存。12. 制备琼脂糖凝胶： 将 50TAE贮存液用蒸馏水稀释成1TAE电泳缓冲液 , 待用，按 1称取适量琼脂糖 , 置于 250ml 锥形瓶中，加入对应量1TAE稀释缓冲液，盖上封口膜，以减少水份蒸发，放入微波炉里加热沸腾，取出摇匀，使瓶壁上粘附的琼脂糖全部溶解，反复 3 次，至琼脂糖全部熔化，放置，待其稍冷却。13. 胶板的制备：将制胶槽置于水平支持物上, 选择合适厚度和齿数的样品梳，插上梳子。向冷却至50-60的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液数滴，摇匀，小心地倒入制胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后，小心拨出梳子，将胶块取出，置于已加入足量 1TAE电泳缓冲液得电泳槽内。14. 加样：取 5L 质粒与 2L 6 加样缓冲液混匀 , 用微量移液枪小心加入样品槽中，在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入5ul 的 100bp DNA ladder 。15. 电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，以 5 V/cm （约 100V）电泳，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 12cm处，停止电泳。16. 成像：戴上一次性手套，在波长为254nm的长波长紫外灯下观察胶块， DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带，用凝胶成像系统照相。五、实验结果六、注意事项1.pH 至 8.0 时，EDTA 才能完全溶解。2. 微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中。3. 观察提取过程中各步骤出现的现象。4. 电泳中使用的EB为中度毒性、强致癌性物质，务必小心，所有与EB有关的试剂、物1 2 3 质粒 pUC19 DNA 琼脂糖电泳检测图1. 100bp DNA ladder 2. 质粒 pUC19 DNA 经 EcoRI 完全酶切3. 自提的质粒 pUC19 DNA 3.0Kb 2.0Kb 2.6Kb 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 15 页，共 30 页 - - - - - - - - - 品及操作，均只能在专门的区域进行，要求必须戴一次性手套，并及时更换。5. 倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀, 速度也不可太快，否则容易出现气泡。6. 保证电泳槽内的电泳缓冲液液面没过胶板表面。7. 每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，加样时要小心操作, 避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。8. 电泳时注意正负极， DNA 片段从负极向正极移动。9. 紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。七、思考题1. 实验中葡萄糖、 EDTA 、Tris-HCl 、KCl、HAc 、NaOH 、SDS 、Tris 饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇的作用是什么？2. 影响电泳结果的因素有哪些？综合型实验（实验三 - 六）综合型实验是指实验内容涉及某课程的综合知识或与某课程相关课程知识的实验, 往往涵盖了几个章节或几门课程所涉及的基本概念、基本理论和基本技能，所以它培养的是学生对知识的综合运用能力，学生还可能根据自己的兴趣和专长，选择不同的知识点加以综合运用，符合了因材施教、发展个性的教育教学培养目标。实验三感受态细胞的制备及转化一、实验目的1. 掌握 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法2. 掌握热激法转化大肠杆菌的原理和方法二、实验原理细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0的 CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物 , 将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如 Ampr等)得到表达， 然后将此细菌培养物涂在选择性培养基(如含有氨苄青霉素（ Amp ）)上。三、实验仪器、材料和试剂名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 16 页，共 30 页 - - - - - - - - - 1. 仪器、用具：高速离心机，恒温摇床，恒温培养箱，分光光度计，恒温水浴锅，高压灭菌锅，培养皿，金属涂棒，吸头，移液枪，枪头，酒精灯，镊子，灭菌牙签，1.5mL 离心管。2. 材料：质粒 pUC19 、大肠杆菌 DH5 3. 试剂：3.