2022年分子生物学第二章核酸的结构和功能电子教案 .pdf

第二章核酸的结构和功能1、主要内容v细胞内的遗传物质v核酸的化学组成与共价结构vDNA 的二级结构vDNA 分子的高级结构v真核生物的染色体及其组装vRNA 的结构与功能v核酸的变性、复性与分子杂交2、教学要求v掌握遗传物质的只要特点和种类；v掌握 DNA 双螺旋结构特点，核酸的变性、复性和分子杂交原理；v熟悉核酸的物理化学性质v熟悉 DNA 多种高级结构第一节细胞的遗传物质一、 DNA 携带两类不同的遗传信息1.遗传物质必须具有的特性a.贮存并表达遗传信息b.能把信息传递给子代c.物理和化学性质稳定d.具有遗传变化的能力lDNA 的特征a)各异的碱基序列储存大量的遗传信息b)碱基互补是其复制、转录表达遗传信息的基础c)生理状态下物理、化学性质稳定d)有突变和修复能力，可稳定遗传是生物进化的基础！遗传物质核酸是如何被证明的？2、DNA 携带两种遗传信息a、编码蛋白质和RNA的信息 (编码tRNA 、rRNA) ：64 个三联体密码子：3 个终止密码子，编码氨基酸的61 个密码子具有简并性、通用性b、编码基因选择性表达的信息原核生物的结构基因占Genome 的比例很大，x174phage 5386bp，结构基因用去5169bp 比例达 96。真核生物的结构基因占Genome 的比例很小，哺乳动物中结构基因只占10 15。其余80以上的DNA起什么作用目前还无法精确解释，但可以肯定其中大部分DNA序列是编码基因选择性表达的遗传信息。表现在：细胞周期的不同时相中个体发育不同阶段不同的器官和组织不同的外界环境下各种基因的表达与否以及量的差异所以又称调控序列二、 RNA 也可作为遗传物质nRNA 病毒：传染媒介是病毒颗粒（病毒基因组RNA 、蛋白质外壳）nTobacco Mosaic Virus (TMV) n类病毒（ viroid ）: 使高等植物产生疾病的传染性因子，只由RNA 组成。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 8 页 - - - - - - - - - 三、是否存在核酸以外的遗传物质nPrion (proteinaccous infections particle) 引起的风波n朊病毒蛋白质样的感染因子1)羊搔痒病(scripie) 2)人类库鲁（kuru）病3)牛海绵状脑炎 (疯牛病 ) n均由传染性病原蛋白颗粒引起，统称Prion (朊病毒 ) 资料： 1982 年，美国加利福尼亚大学教授斯坦利?普利西纳提出雅克氏病的病原体是一种“蛋白质性质的感染颗粒”，并用prion（普利昂）一词表示这种因子，国内曾译为朊病毒或锯蛋白。但这种蛋白质粒子缺乏核酸，称为病毒并不妥当，故现在称为朊毒体。疯羊病、疯牛病及人类所患的新型雅克氏症等海绵状脑病，都是由朊毒体发生变异引起的。包括人在内的哺乳动物体内都存在朊毒体，它在正常形态下呈折叠状，但变异时会张开如同锯齿状，在大脑中撑出大量的小洞，引起人或动物患上痴呆型的传染性海绵状脑病。朊毒体的致病过程是：首先经一定传播途径（如进食患病动物的肉和内脏）侵入机体并进入脑组织，其后沉积于不同的神经元溶酶体内，导致被感染的脑细胞受损、坏死，释出的朊毒体又侵犯其它脑细胞，使病变不断发展；病变的神经细胞死亡后，脑组织中留下大量小孔呈海绵状，并出现相应的临床症状，这就是众所周知的海绵状脑病。普利西纳学说公布之初，在学术界曾遭到猛烈反对，多数人持否定态度。因为分子生物学的中心命题是“生物的遗传基因以核糖核酸和脱氧核糖核酸为本体”，在此之前，人们普遍认为，不存在没有核酸的病原体，这已成为常识，但普利西纳的学说却与这种认识背道而驰。经过10 多年的研究和争论，大量事实确证了朊毒体的存在，普利西纳的学说最终得到了认可。鉴于这一发现的重大科学价值，普利西纳荣获1997 年度诺贝尔生理学或医学奖。第二节核酸的化学组成一、含氮碱基、核苷、核苷酸lDNA is a nucleotide polymer with covalent bonds between the sugar and Phosphate groups. lA long molecular chain containing a sugar, a phosphate and one of four different nucleotide bases. lChemical Composition （化学组成） : Sugar(糖): Deoxyribose (ribose 核糖 in RNA) Phosphate(磷酸 ): - phosphodiester Bases(碱基 ): (G) guanine (C) cytosine (A) adenine (T) thymine ！稀有碱基：假尿苷（） 、二氢尿嘧啶（DHU ） 、 2-O-甲基腺苷、 N6，N6-二甲基腺苷。名称与缩写 (1) ?RNA ：ribonucleic acid 核糖核酸?DNA ：deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸?pyrimidine ：cytosine (Cyt) 胞嘧啶嘧啶thymine (Thy) 胸腺嘧啶uracil (Ura) 尿嘧啶?purine：adenine (Ade) 腺嘌呤嘌呤guanine (Gua) 鸟嘌呤名称与缩写 (2) ?ribonucleoside 核糖核苷（不带磷酸）adenosine (Ado) 腺(嘌呤核 )苷名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 8 页 - - - - - - - - - guanosine (Guo) 鸟 (嘌呤核 )苷cytidine (Cyd) 胞(嘧啶核 )苷thymidine (Thd) 胸(腺嘧啶脱氧核 )苷uridine (Urd) 尿(嘧啶核 )苷?ribonucleotide 核糖核苷酸（带磷酸）adenosine 5- mono (di, tri) phosphaste ；AMP, ADP, ATP ?deoxyribonucleoside 脱氧核糖核苷deoxyadenosine (dAdo) ?deoxyribonucleotide 脱氧核糖核苷酸dAMP, dADP, dATP dNTP 二、 DNA 分子的一级结构1. 多聚核苷酸链主链是核糖和磷酸，侧链为碱基，由3,5磷酸二酯键连接2. 链的方向：同一个磷酸基的5酯键到3酯键的方向 (5 3) 3、DNA 一级结构的特点a. 脱氧核糖是其显著特点DNA 极其稳定的根本原因b、磷酸呈四面体构型，脱氧核糖呈折叠的五元环，碱基是平面的c、主链是亲水的，侧链（碱基）是疏水的n主链的脱氧核糖的羟基能与水形成氢键，而磷酸基团在生理条件下离解为负离子, 这些特点保证了多核苷酸链可形成稳定的构象。4、一级结构的概念n指 DNA 分子中的核苷酸排列顺序n不同生物借此贮存遗传信息n决定 DNA 的二级结构和高级结构第三节核酸二级结构一、 DNA 双螺旋模型的提出依据na.1938. W. T. Astbury 首次用 X射线分析DNA nb.1950 Chargaff A + G / T + C = 1 A+T G + C nc.1952 Alexander Todd 发现了核苷酸和核苷酸之间由磷酸二酯键联接nd.1952 M.H.F.Wilkins & Rosalind Franklin 得到了高度定向的DNA 纤维的 X-射线照片发现原子长轴存在0.34 和 3.4nm 两种周期性n此外，之前的密度测定表明螺旋由两条多核苷酸链组成，且直径恒定（2nm)。Watson-Crick 的 DNA 双螺旋n两条相互独立的单链DNA 分子以螺旋方式相互缠绕，形成右手双螺旋；n带有负电的戊糖-磷酸骨架在分子的外侧；n碱基则平面堆积于螺旋的内部；n由于骨架双链在螺旋轴上的间距不相等，从而在分子表面形成大沟和小沟。大沟和小沟。双螺旋表面的沟对DNA和蛋白质的相互识别是很重要的，因为在沟内才能觉察到碱基的顺序，而在双螺旋的表面，是脱氧核糖和磷酸重复结构，没有信息可言。（蛋白质核酸，核酸核酸、锌指结构）n双螺旋模型参数n直径 20?名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 8 页 - - - - - - - - - n螺距为 34? (任一条链绕轴一周所升降的距离) n每圈有 10 个核苷酸 (碱基 ) n两个碱基之间的垂直距离是3.4?。螺旋转角是36 度。n有大沟和小沟，配对碱基并不充满双螺旋空间，且碱基对占据的空间不对称。二、影响双螺旋结构稳定性的因素氢键范德华力（ Van de waals force）疏水作用力(Hydrophobic interaction) * 不稳定因素n磷酸基团间的静电斥力n碱基内能增加(温度 ), 使氢键因碱基排列有序状态的破坏而减弱三、双螺旋结构多样性B-DNA ：资料来自相对湿度为92所得到的DNA 钠盐纤维。此外人们还发现了A、C、 D、E 等右手双螺旋和左手双螺旋Z 构象等形式。DNA 结构的多态性：几种不同的DNA 双螺旋结构以及同一种双螺旋结构内参数存在差异的现象。原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键，磷酸二酯键的两个P-O 键、糖苷键、戊糖环各个键。第四节DNA 的高级结构1、反向重复序列与二级结构n反向重复序列（inverted repeatitive sequence or inverted repeats, IR）,又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同时存在于一个分子中，但具有相反的方向。有时也有不完全相同的情况。RNA 和 DNA 中都可能存在n此外还可有directed repeatitive sequence -正向重复序列n较短的回文序列可能是作为一种信号n如：限制性内切酶的识别位点n一些调控蛋白的识别位点n例如限制性内切酶EcoR的识别位点5 GAA TTC 33 CTTAAG 52. DNA (Trible Helix DNA, T.S DNA)的三股螺旋结构（1）发现和证实1953 年， Watson & Crick D.S DNA model证明沿大沟存在多余的氢键给体与受体潜在的专一与DNA (蛋白质 )结合的能力形成 T.S DNA 可能性1957 年 Felsenfeld 等发现一股为嘌呤，另一股为嘧啶的核苷酸双链能够形成三链如：polyA/polyU polydA/polydT polyd (AG)/polyd(CT) 三螺旋DNA 的概念提出1987 年 Mirkin . S . M证明 plasmid DNA 在 pH= 4.3 的溶液中 , 有 T.S DNA 的存在，这些发现促进了三螺旋DNA 的研究（2）组成形式a、D.S. DNA + D.S.DNA T.S. DNA + S.S. DNA b、分子组成PY/PU + PU (偏碱性介质中稳定) GG 、 AA 、GC名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 8 页 - - - - - - - - - PY/PU + PY (偏酸性介质中稳定) 常见类型GCAT 3、四股螺旋DNA ( tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA 结构特点：基本结构单元鸟嘌呤四联体可能的功能：A、稳定真核生物染色体结构B、保证 DNA 末端准确复制C、与 DNA 分子的组装有关D、与染色体的meiosis & mitosis 有关4、DNA 的超螺旋结构超螺旋 (superhelix OR supercoil)的形成和类型l 形成松驰态 DNA （relax form ）低能量常态超螺旋（ Supercoied） DNA 正超螺旋负超螺旋DNA 的超螺旋结构正超螺旋（ positive supercoiled ）紧缠 overwinding ( 右旋 )负超螺旋（ Negative Supercoiled ）松缠 unwinding ( 左旋)原核生物 DNA 的三级结构：n绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构。超螺旋的定量描述nWhite 方程：L=T+W n连接数 L（Linking nnmber ） ：指 cccDNA 中一条链绕另一条链的总次数。其特点是(1) L 是整数；(2) 在 cccDNA 的任何拓扑学状态中其值保持不变；(3) 右手螺旋对L 取正值。nT（ Twisting number） ：盘绕数，即DNA分子中Watson-Crick 螺旋数，初级螺旋圈数。其特点是：(1) 可以是非整数；(2) 是变量；(3) 右手螺旋时T 为正值。nW（Writhing number） ：超盘绕数，即超螺旋数，直观上为双螺旋在空间的转动数。其特点是：(1)可以是非整数；(2)是变量；l(3)右手螺旋时， W 取负值。l拓扑异构酶解超螺旋的特点。第五节真核生物的染色体及其组装一、真核细胞染色体组成1、组成： DNA 和蛋白质 ,以及少量的RNA. 2、染色体体和染色质的概念v染色质 (chromatin) ：是指细胞周期间期细胞核内由DNA 、组蛋白、非组蛋白和少量 RNA 组成的复合结构，因其易被碱性染料染色而得名。v染色体 (chromosome)：是指在细胞分裂期出现的一种能被碱性染料强烈染色，并名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 8 页 - - - - - - - - - 具有一定形态、结构特征的物体。携带很多基因的分离单位。只有在细胞分裂中才可见的形态单位。！分类：v常染色质 (euchromatin) （间期纤丝的包装密度度比分裂期染色体的要小很多）v异染色质 (heterochromatin) （间期纤丝染色质区的包装密度十分致密，可与有丝分裂期染色体相比）组成型异染色质(constitutive heterochromatin) 兼性异染色质(facultative heterochromatin) 3、染色体中的蛋白质组蛋白分为H1、H2A 、H2B 、H3 和 H4。其特性：v进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3 和 H4。v无组织特异性到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1 而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白两个例外。v肽链上氨基酸分布不对称性碱性氨基酸集中分布在N 端的半条链上。v组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化及ADP 核糖基化等。v富含赖氨酸的组蛋白H5 非组蛋白：(1)HMG 蛋白（ high mobility group protein ）, 这类蛋白可能与DNA 的超螺旋结构有关。(2)DNA 结合蛋白可能是一些与DNA 复制或转录有关的酶或调节物质。(3)A24 非组蛋白位于核小体内功能不详。4、核小体的形成八聚体在中间，DNA盘绕在外而H1 则在核小体的外面，每个核小体只有一个H1。所以核小体中组蛋白和DNA 的比例是每200bpDNA 有 H2A ，H2B ，H3，H4 各两个， H1 各一个。5、染色体的高级包装v核小体的形成是染色体压缩的第一阶段，约1/7；v螺旋管的每个螺旋包含6 个核小体，压缩比为6；v中期的染色质是一个细长中空的圆筒，为400nm, 由 30nm 螺旋管缠绕而成，压缩比为 40; v这个超螺旋圆筒进一步压缩1/5 便成为染色单体，总压缩比是7x6x40 x5 ，将近10000 倍。第六节RNA 的结构与功能一、 RNA 的功能：l信息分子遗传信息由DNA 到蛋白质的中间体的核心作用。l功能分子1.作为细胞内蛋白质生物合成的主要参与者，参与在蛋白质合成中核蛋白复合物的结构组成和功能发挥；2.具有生物催化的功能，作用于初始转录产物的剪接加工；3.与生物机体的生长发育密切相关，参与基因的表达调控；4.与生物体的进化有很大的关系。5.核糖体6.信息体7.拼接体8.编辑体二、 RNA 的分类vmRNA 的结构名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 8 页 - - - - - - - - - vtRNA 的结构vrRNA 的结构vsnRNA vsnoRNA v非编码 mRNA ！每种 RNA 的基本结构和功能！ ！ ！ ！ ！第七节核酸的物理化学性质DNA双股链的互补是其结构和功能上的一个基本特征，也是DNA研究中一些实验技术的基础。一、 DNA 分子的变性1、条件：加热，极端pH，有机溶剂（尿素、酰胺)，低盐浓度等2、变性过程的表现是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很窄的温度范围导致一些理化性质发生剧烈变化3、熔解曲线与Tm 值缓慢而均匀地增加DNA 溶液的温度（现可做到0.1 分）可根据各点的A260 值绘制成 DNA 的熔解曲线。Tm= of Ct = C0/2 = OD增加值的中点温度(一般为 85-95) 或 DNA 双螺旋结构失去一半时的温度这也是一般PCR 实验技术中把变性温度定为94 的原因。4、影响Tm 值的因素（1）在A, T, C, G 随机分布的情况下，决定于GC 含量nGC%愈高Tm 值愈大nGC%愈低Tm 值愈小（2）GC%含量相同的情况下AT 形成变性核心，变性加快，Tm 值小。碱基排列对Tm 值具有明显影响生物体内仅UAA 为最有效的终止密码子n因为： UAA 、AUU 的 Tm 值是最低的一个，即使生理温度下也不稳定。二、 DNA 分子的复性（anneal or renaturation）n概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以重新地合成双螺旋结构的过程（退火） 。根据复性动力学公式我们可以知道什么？(1) 单链浓度随着时间的增大而减小；(2) 反应速率取决于初始的单链浓度Co；(3) 以反应浓度和COt1/2 为座标可绘复性曲线; (4) 通过 COt1/2 值可测原核生物基因组的大小; 已知大肠杆菌的基因组为4.2x106bp, COt1/2 = 9M.Sec 则(5)原核生物基因组大小不同，复性曲线也不同; (6) 可用以区分真核生物和原核生物基因组。在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢？可以通过哪些法来检测？(1) 减色效应（ hpochromic effcef ）测定光密度，即OD 值(optical density ） ，DNA 从单链变成双链，OD260 减少 30% (2) 羟基磷灰石柱层析羟基磷灰石对双链DNA 吸附较牢，不易吸附单链。四、核酸分子杂交（hybridization ）杂交形式：n液相杂交名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 8 页 - - - - - - - - - n固相杂交 (滤膜杂交 ) 1975 E. M. Southern Southern blot S.S. DNA S.S. DNA 1977.J.C. Alwine Northern blot S.S. RNA S.S. DNA 1978.Hany Towbin Western blot Protein (antigen ) antibody 固相分子杂交(1975 E. M. Southern) ！复习思考题1、碱基、核苷、核苷酸的化学组成2、核酸的一级结构书写方向3、Watson Crick 的 Double Helix Model 参数大小沟二级结构的多态性4、影响二级结构的作用力：稳定因素不稳定因素5、DNA 的不寻常结构：反向重复序列三螺旋 DNA 四链 DNA 6、真核生物的染色体：核小体的组成和组装染色体的多级包装组蛋白和非组蛋白7、RNA 的种类及其相关结构和功能与及应用8、变性：溶解曲线Tm 影响因素（ GC、化学试剂、盐、pH）9、复性C0t 曲线C0t（12）10、核酸分子杂交的类型11、DNA 的超螺旋结构形成、类型名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 8 页 - - - - - - - - -