2022年反转录实验步骤总结 .pdf

1 一前期对一些重要试剂用量的评估（以mRNA 100ng为计算标准）1.如果原材料 0.2g （约 5 株 2 周苗期的苗）， 分成两管，每管 0.1g， 则分别加 TRIzol 2ml （共 4ml） ， 也就是说，每个生物样品作两次生物重复的话。 每瓶 TRIzol有 100ml，所以可以做 25 个材料。2.一个材料作二次生物重复，需要4 根 Zymo RNA纯化柱。一个标准 Zymo Kit 有100 个反应柱子，也就是可以做25 个材料。3.RNA fragmentation完整 Kit 可以做 100 个样品。4.mini/midi Kit 可以做 12 个柱子反应。二前期准备工作1.DEPC 处理的 Rnase free水；2.RNA专用的 75%乙醇、异丙醇、三氯甲烷和NaOAc ；3.220烘烤6小时的研磨棒、器皿和药匙；4.足够的液氮；三其它小知识理论上，每 100mg 材料可以获得 100-200ug total RNA ，纯化后获得的 mRNA的量约为 total RNA量的 1/100。四具体实验步骤（一） TRIzol提取总 RNA 1先将研磨棒等用液氮预冷， 然后加液氮粉碎叶片 （组织） ，越细越好。2准备好 TRIzol管，每 50-100mg 材料加入 1mlTRIzol （材料体积应小于TRIzol体积的 10%） ，振荡或用移液器打至无大颗粒（震荡2 分钟可） 。3悬液室温放置 5min(可 30min 放置)。再加入 1/5V（起始体积）氯仿，剧烈振荡 1-2 分钟， 室温放置 5min。 然后 13000rpm 2-8 离心 30 min。4吸取无色上清（约有1/2 的起始体积量），加入 1/2 V（起始体积）异丙醇。室温放置 10 min。然后 13000rpm 2-8 离心 30 min。5弃上清液。沉淀物以75%乙醇洗涤（ 1ml 乙醇/1mlTRIzol） 。然后13000rpm 2-8 离心 10min。6空转一次，吸去上清。7适当干燥 5 min。加入经 DEPC 处理的 Rnase free水 100ul，冰浴 1 小时。8检测： 2l电泳检测，另取 1l稀释 10倍后测 OD值。9【用 RNase free 的 Dnase酶切。 （一般 100ug 的总 RNA中加 4%-5%V的 RNase inhibitor和 10-20U的 Dnase ，然后 37 30 min） 。 】10如果暂时不用，可以加1 /10V 的 3M PH5.5的 NaOAc和 3V体积无水乙醇， -80放置 2 小时以上或 overnight。然后 12500rpm 2-8 离心15 min，重复 step 5-7。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 3 页 - - - - - - - - - 2 （二）从总 RNA提取 mRNA （Oligotex mRNA Midi Kit ） （REPEAT ）(NOTE: Oligotex 、 OBB先 37 预热，然后振荡，25备用。 OEB 70 预热。 ) 1根据以下表格依次混合在1.5ml 微离心管内。须充分混合。total RNA add Rnase-free water to total RNA sample: Buffer OBB( l) Oligotex Suspension(l) =0.25mg 250l 250 15 (mini Kit) 0.25-0.50mg 500l 500 30 (midi Kit) 0.50-0.75mg 500l 500 45 (midi Kit) 0.75-1.00mg 500l 500 55 (midi Kit) 2在 70水浴 3 min。再室温放置 20 min。然后以 14000-18000 rpm 离心 2 min，直至上清液澄清。（可将所弃上清液另外保留，第一遍提取结束后回收原先的 Oligotex再次加 10l 新的 Oligotex， 第二遍提取 mRNA 。 ）3沉淀用等体积的OBB和 Rnase-free Water 充分振荡混合，再70水浴 3 min。再室温放置 20 min。然后以 14000-18000 rpm 离心 2 min，直至上清液澄清。4用 400l的 Buffer OW2 充分振荡混合，转移至小离心柱放置于1.5ml微离心管内，以 14000-18000 rpm 离心 1 min；重复此步骤。5再以 14000-18000 rpm 空转离心 1 min。6将此小离心柱换入新的Rnase-free的 1.5ml 微离心管内。 把 70预热的Buffer OEB 75l加入离心柱中，用移液器吹打 3-4下后， 即以 14000-18000 rpm 离心 1 min 进行洗脱。为了保证能彻底的洗脱下来，重复此步骤，最后为 150l。（NOTE :多样品时，为保证洗脱效率，可将内置小离心柱的微离心管先置于70预热。 ）7适量电泳检测。另取适量测OD值。（三）纯化 mRNA （每柱量 10000 rpm 离心 1 min。2.然后加 350l Wash Buffer 至离心柱，以 10000 rpm 离心 1 min。重复此步骤。3.再以 10000rpm 空转离心 1 min。4.将此小离心柱换入新的Rnase-free 的 1.5ml 微离心管内。用43l Rnase-free Water洗脱，放置 1 min 后以10000 rpm 离心 1 min；重复此步骤，最后为 86l。5.取 1l电泳检测，另取 1l稀释 10 倍后测 OD值。6.加 1/10V 的 3M PH5.5的 NaOAc和 3V 体积无水乙醇，-80 30min-2 小时。7.10000rpm 4离心 30min， 弃上液， 加 75%乙醇 400ul 洗， 再 10000rpm 4离心 3min，弃上液，适当晾干5min，溶解于 9ul Rnase free 水中（冰浴放置 30min-2 小时） 。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 3 页 - - - - - - - - - 3 （四）mRNA fragmentation 1.将 9ul 的 mRNA样品转移到 200ul PCR专用 tube 管中， 再加 10XFragmentation Buffer（Ambion，#AM8740）1ul，放置于 PCR仪 70 度 5 分钟。2.加入 1ul Stop Buffer （Ambion，#AM8740） ，立即置于冰上。3.转移到 1.5ml 的 tube 管中，依次加入 1ul 3M NaOAc （PH5.2 ） ，2ul glycogen（Ambion，#AM9510） ，30ul 100% EtOH ，-80 度放置 30 分钟。4.以 14000rpm 4 度离心25 分钟沉淀，弃上液，加75%乙醇 400ul 洗，再10000rpm 4离心 3min，弃上液，适当晾干5min，溶解于 10.5ul Rnase free水中（冰浴放置 30min-2 小时） 。（五）First strand cDNA synthesis 1.将 10.5ul 样品转移到 200ul PCR 专用 tube 管，然后加入 1ul Random Hexamer Primers（3ug/ul，Invitrogen，#48190-011） ，在 PCR仪 65 度放置 5 分钟，立即置于冰上。2.准备以下的 mixture，充分混合 ，保证能提供 7.5ul mixture 至一个样品。依次 5X first strand buffer（Invitrogen，#18064-014）4ul；100mM DTT （Invitrogen，#18064-014）2ul；dNTP mix （10mM）1ul；RnaseOUT （40U/ul） （Invitrogen，#10777-019）0.5ul 3.将 7.5ul mixture 加入样品中，充分与样品混合，25 度放置 2 分钟。4.加 1ul SuperScript II（200U/ul，Invitrogen，#18064-014）到样品中，按以下程序依次加热或置冷：25 度 10 分钟-42度 50 分钟-70度 15 分钟-4度 hold （以上每个样品实际量为20ul）（六）Second strand cDNA synthesis 1.直接在样品加入 51ul 水。2.依次加入 5XSecond strand buffer（Invitrogen，#10812-014）20ul，dNTP mix（10mM）3ul，充分混合，再冰上放置5 分钟。3.加入 RNaseH（2U/ul， Invitrogen， #18021-014） 1ul， DNA Pol I（10U/ul， Invitrogen，#18010-025）5ul，充分混合，在 PCR仪 16 度放置 2.5 小时。（以上每个样品实际量为100ul）4.进行样品 DNA纯化（ Qiagen，#28106） ：即每个样品中加500ul PB ，转入柱子中， 12500rpm 离心 1 分钟，弃去下液，柱子中加750ul PE ，12500rpm 离心 1 分钟，弃去下液，再空转1 分钟，放置 1 分钟，柱子换入新的tube 管中，加入 16ul EB洗脱，再加入 16ul EB洗脱第二次 . 5.各取 2ul 测 OD值。样品后续交给测序组，用Illumina Genomic DNA Sample Prep Kit（#1000181）继续样品制备，上样测序。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 3 页 - - - - - - - - -