生物技术概论.docx

_一、生物技术的定义 生物技术（biotechnology），有时也称生物工程（bioengineering），是指人们以现代生命科学为基础, 结合其他基础学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。因此，生物技术是一门新兴的、综合性的学科。 先进的工程技术手段是指基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程等新技术。改造生物体是指获得优良品质的动物、植物或微生物品系。生物原料则指生物体的某一部分或生物生长过程所能利用的物质，如淀粉、糖蜜、纤维素等有机物，也包括一些无机化学品，甚至某些矿石。为人类生产出所需的产品包括粮食、医药、食品、化工原料、能源、金属等各种产品。达到某种目的则包括疾病的预防、诊断与治疗、环境污染的检测和治理等。 二、生物技术的研究内容 根据生物技术操作的对象及操作技术的不同，生物技术主要包括以下5 项技术（工程）。 （1）基因工程 基因工程（gene engineering）是应用人工方法把生物的遗传物质 （DNA）分离出来，在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组了的DNA 导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性; 有时还使新的遗传信息（基因）在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（多肽或蛋白质）。这种创造新生物并给予新生物以特殊功能的过程就称为基因工程，也称为DNA 重组技术。 （2）细胞工程 细胞工程（cell engineering）是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植物个体，或获得某种有用的物质的过程。细胞工程应包括动、植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术（也称细胞杂交技术)、细胞器移植技术等。 （3）发酵工程 发酵工程（fermentation engineering）是利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，在合适条件下通过现代化工程技术手段，由微生物的某种特定功能生产出人类所需的产品称为发酵工程,有时也称微生物工程。 （4）酶工程 酶工程（enzyme engineering）是利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。它包括酶的固定化技术、细胞的固定化技 术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计等技术。 （5）蛋白质工程 蛋白质工程（protein engineering）是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要的新型蛋白质。 一、改善农业生产、解决食品短缺 （1）提高农作物产量及其品质 1、培育抗逆的作物优良品系 通过基因工程技术对生物进行基因转移，使生物体获得新的优良品性，称之为转基因技术。利用转基因技术可以培育出具有抗寒、抗旱、抗盐、抗病虫害等抗逆特性及品质优良的作物新品系，如转苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt）毒蛋白基因的抗虫棉花。 2、植物种苗的工厂化生产 利用细胞工程技术对优良品种进行大量的快速无性繁殖，实现工业化生产，即植物微繁殖技术，又称植物微繁殖技术。利用这种无性繁殖技术，可在短时间内得到遗传稳定的、大量的小苗（试管苗），并可实现工厂化生产。利用植物微繁殖技术还可培育出不带病毒的脱毒苗。 植物的微繁殖技术已广泛地应用于花卉、果树、蔬菜、药用植物和农作物的快速繁殖。 3、提高粮食品质 生物技术除了可培育高产、抗逆、抗病虫害的新品系外，还可培育品质好、营养价值高的作物新品系。例如，科学家将水仙花和玉米合成-胡萝卜素的基因导入水稻培育出高-胡萝卜素含量的水稻（GoldenRice，黄金稻）（图1-1）。 图1-1黄金稻 a：普通水稻；b：转水仙花-胡萝卜素合成基因水稻；c：转玉米-胡萝卜素合成基因水稻 4、生物固氮，减少化肥使用量 现代农业均以化学肥料，如尿素、硫酸铵作为氮肥的主要来源。化肥的使用不可避免地带来了土地的板结，肥力的下降；化肥的生产又将导致环境的污染。科学家们正努力将具有固氮能力的细菌的固氮基因转移到作物根际周围的微生物体内，希望由这些微生物进行生物固氮，减少化肥的使用量。 5、生物农药，生产绿色食品 近年来，人们越来越注意农业生产的可持续发展及人与环境的协调，特别是由于化学农药的毒性作用及筛选新农药的艰难，企业和研究人员开始把注意力转向生物农药的研究开发与使用。因其不污染环境，对人和动植物安全，不伤害天敌，所以发展生物农药已成为保障人类健康和农业可持续发展的重要趋势。 （2）发展畜牧业生产 1、动物的大量快速无性繁殖 1997年2月英国Roslin研究所的Wilmut等在Nature杂志上刊登了用绵羊乳腺细胞培育出“多莉”（图1-2）。证明动物体细胞也具有全能性，同样有可能进行动物的大量、快速无性繁殖。 图1-2“多莉”及其代孕母亲（苏格兰黑面绵羊） 二、培育动物的优良品系 利用转基因技术，将与动物优良品质有关的基因转移到动物体内，使动物获得新的品质。1983年美国学者将大鼠的生长激素基因导入小鼠获得转基因小鼠。除了小鼠外，科学家们已成功地培育了转基因羊、转基因兔、转基因猪、转基因鱼等多种动物新品系。 2、提高生命质量，延长人类寿命 （1）开发制造奇特而又贵重的新型药品 1977年，美国首先采用大肠杆菌生产了人类第一个基因工程药物人生长激素释放抑制激素。利用基因工程生产的药物，除了人生长激素释放抑制激素外，还有人胰岛素、人生长激素、人干扰素等。 （2）疾病的预防和诊断 传统的疫苗生产方法对某些疫苗的生产和使用，存在着免疫效果不够理想、被免疫者有被感染的风险等不足。利用基因工程生产重组疫苗可以达到安全、高效的目的。如已经上市或已进入临床试验的病毒性肝炎疫苗；肠道传染病疫苗（包括霍乱、痢疾等）等。 利用细胞工程技术可以生产单克隆抗体。单克隆抗体既可用于疾病治疗，又可用于疾病的诊断。利用基因工程技术还可生产诊断用的DNA试剂。 （3）基因治疗 导入正常的基因来治疗由于基因缺陷而引起的疾病，一直是人们长期以来追求的目标。1990年，美国FDA批准了用ADA(腺苷脱氨酶基因)基因治疗严重联合型免疫缺陷病，并取得了较满意的结果。 三、解决能源危机、治理环境污染 （1）解决能源危机 生物能源将是最有希望的新能源之一，而其中又以乙醇最有希望成为新的替代能源。科学家们希望找到一种可以利用大量的农业废弃物如杂草、木屑、植物的秸杆等纤维素或木质素类物质或其他工业废弃物作的微生物。通过微生物发酵或固定化酶技术，将农业或工业的废弃物变成沼气或氢气。 （2）环境保护 传统的化学工业生产过程大多在高温高压下进行，是一个典型的耗能过程并带来环境的严重恶化。如果改用生物技术方法来生产，不仅可以节约能源还可以避免环境污染。例如用化学方法生产农药，不仅耗能而且严重污染环境，如改用苏云金杆菌生产毒性蛋白，即可节约能源而且该蛋白质对人体无毒。 四、制造工业原料、生产贵重金属 （1）制造工业原料 利用微生物在生长过程中积累的代谢产物，生产食品工业原料，种类繁多。概括起来，主要有以下几个大类：氨基酸类，主要有谷氨酸(即味精)、赖氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、缬氨酸等；酸味剂，主要有柠檬酸、乳酸、苹果酸、维生素C等；甜味剂，主要有高果糖浆、天冬甜精、氯化砂糖。 发酵技术还可用来生产化学工业原料。主要有传统的通用型化工原料如乙醇、丙酮、丁醇等产品。 （2）生产贵重金属 一、基因工程的定义 在漫长的生物进化过程中，基因重组从来没有停止过。在自然力量及人类干扰下，通过基因重组、基因突变和基因转移等途径，生物界无止境地进化,，不断使物种趋向完善,出现了今天各具特性的繁多物种。有的能忍耐高温，有的不怕严寒，有的能适应干旱的沙漠，有的可在高盐度的海滩上或海水中生繁，有的能固定大气中的氮素种种生物的特殊性状成为今天定向改造生物、创造新物种的丰富遗传资源。但是没有一种生物是完美无缺的，因此，有待科技工作者有目的地去进一步改造。按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物特性，在较短的时间内使现有物种的性能得到改善，创造出更符合人们需要的新的生物类型，或者利用这种技术对人类疾病进行基因治疗，这就是基因工程。 基因工程最突出的优点是打破常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间，动物与植物之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行相互重组和转移。在冶金工业方面，面对数量庞大的废渣矿、贫矿、尾矿、废矿，采用一般的采矿技术已无能为力，惟有利用细菌的浸矿技术才能对这类矿石进行提炼。可浸提的金属包括金、银、铜、铀、锰、钼、锌、钴、镍、钡、铊等10多种贵重金属和稀有金属。 1、基因工程研究的理论依据 （1）不同基因具有相同的物质基础 地球上几乎所有的生物，从细菌到高等动物和植物直至人类，它们的基因都是一个具有遗传信息的DNA片段。所有生物的DNA的组成和基本结构都是一样的。因此，不同生物的基因（DNA片段）原则上是可以重组互换的。虽然有些病毒的基因是RNA，但这些病毒的RNA仍可以通过反转录产生cDNA（complementaryDNA，互补DNA），并不影响不同基因之间的重组。 （2）基因是可以切割的 基因直线排列在DNA上。除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列。因此，作为DNA分子上一个特定核苷酸序列的基因，允许从DNA分子上一个一个完整地切割下来。 （3）基因是可以转移的 基因不仅是可以切割下来的，而且携带基因的DNA分子可以在不同生物之间转移，或者在生物体内的染色体上迁移，甚至可以在不同染色体间跳跃，插入到靶DNA分子中。由此表明，基因是可以转移的，而且是可以重组的。转移后的基因一般仍有功能。 （4）多肽与基因之间存在对应关系 普遍认为，一种多肽就有一个相对应的基因。因此，基因的转移或重组最终可以根据其表达产物多肽的性质来考察。 （5）遗传密码是通用的 所有生物从低等的病毒直至人类，蛋白质合成都使用同一套遗传密码，只有少数例外，也就是说遗传密码是通用的。重组的DNA分子不管导入什么样的生物细胞中，只要具备转录翻译的条件，其上面的遗传密码均能转录翻译出相应的氨基酸。即使人工合成的DNA分子（基因），其上面的遗传密码同样可以转录翻译出相应的氨基酸。 （6）基因可以通过复制把遗传信息传给下一代 经重组的基因在合适条件下是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。 3、基因工程操作的基本技术路线 基因工程是一项比较复杂的技术，如果抛开细节问题，基因工程操作的基本技术路线如图2-1所示。 图2-1基因工程的基本技术路线 以上技术路线概括为4个步骤：获得目的基因；构建克隆载体；目的基因与克隆载体重组后导入受体细胞；获得克隆子；对克隆子中目的基因进行检测和鉴定。 一、DNA的组成与结构 （1）DNA的组成 DNA是一类由4种脱氧核苷酸按照一定的顺序聚合而成的大分子。脱氧核苷酸分子由脱氧核糖、磷酸和碱基组成。脱氧核糖的第一位碳原子(1') 上连接一个碱基，第5 位碳原子(5') 上连接一个磷酸基团，组成一个脱氧核苷酸。一个脱氧核苷酸的脱氧核糖的5'磷酸基团和另一个脱氧核苷酸的脱氧核糖的3'羟基结合形成磷酸二酯键, 把两个脱氧核苷酸连接在一起。多个脱氧核苷酸按此方式连接成多聚脱氧核苷酸, 其一端为游离的5'磷酸基团（5'-P），称为5'端，而另一端为游离的3'羟基（3'-OH），称为3'端（图2-1）。如果连接成的多聚脱氧核苷酸是环状的，则无游离的'端和3'端。 图2-1 DNA的一段多聚脱氧核苷酸链 组成DNA的碱基有腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）4种，分别含有这4种碱基的脱氧核苷酸依次称为腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸。多聚脱氧核苷酸链中，各种脱氧核苷酸的脱氧和糖和磷酸的结构和位置是一致的，不同的只是碱基，因此多聚脱氧核苷酸链（DNA链）中的脱氧核苷酸可以用碱基来表示。例如5'端开始依次由脱氧鸟苷酸、脱氧胞苷酸、脱氧胞苷酸、脱氧腺苷酸、脱氧胸苷酸连接成的多聚脱氧核苷酸片段可用碱基5'-GCCAT-3'表示。 （2）DNA的结构 DNA通常以双链形式存在。两条脱氧核苷酸链总是按碱基A与T、G与C互补配对，通过氢键形成稳定的双螺旋结构，称为双链DNA (图2-2)。绝大部分生物细胞中的DNA都是双链，只有少数病毒（噬菌体）中的DNA以单链形式存在。 图2-2 DNA双链示意图 二、DNA的功能 （1）DNA分子能在细胞内复制 DNA的功能之一是在细胞内能够进行半保留复制。复制后，新产生的双链DNA分子中含有一条旧链和一条新链，使DNA携带的信息可以精确传递。 （2）携带遗传信息 DNA是生物界遗传信息的主要携带者，DNA上的部分核苷酸序列决定着RNA的核苷酸序列。通过转录，这些核苷酸序列分别指令转录出核糖体RNA（rRNA）、转移RNA（tRNA) 和信使RNA(mRNA）。rRNA是核糖体的一部分；tRNA在蛋白质合成过程中转运氨基酸；mRNA上的核苷酸序列编码蛋白质的氨基酸序列，经过翻译把遗传信息进一步传递给蛋白质（多肽）。 基因应包括转录启动子的序列和转录区的序列。在转录过程中，构成启动子的序列不转录出相应的RNA序列，只有转录区的序列才转录出相应的RNA序列。 一个基因或一个操纵子能否有效转录，首先取决于其上游是否存在有效的启动子。启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点。转录区从转录的起始位点开始，包括基因编码区和转录终止子。 基因编码区指转录mRNA上起始密码AUG（少数为GUG）至终止密码UAG（UAA、UGA）的各种遗传密码的核苷酸序列。原核生物的转录区有的是由2个或2个以上基因组成的操纵子。组成同一操纵子的所有基因共用一个启动子，但是每个基因的编码区都含有起始密码序列和终止子序列，两个基因编码区之间往往含有非编码的间隔序列。真核生物的转录区，一个启动子只控制转录一个基因的编码区，但编码区内除了各种编码序列以外，往往含有一个或几个长度不同的非编码间隔序列区，称为内含子（intron）。被内含子分隔的编码序列，称为外显子（exon）。 在基因编码区下游有一段使转录终止的核苷酸序列，称为转录终止子（terminator）。一个操纵子虽然由多个基因组成，但与启动子一样也只需要一个终止子。 一、限制性核内切酸酶和DNA片段化 （1）限制性核内切酸酶 限制性内切核酸酶(restrictionendo-endonuclease)能识别双链DNA中特定核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具5-磷酸基（-P）基和3-羟基（-OH）的DNA片段的内切脱氧核苷酸酶(endo-deoxyribonuclease)。至今发现的限制性内切核酸酶有型酶、型酶和型酶。基因工程操作中真正有用的是型酶。如果没有专门说明，通常所说的限制性内切酶就是型酶。 （2）限制性核内切酸酶的识别序列 限制性内切核酸酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列 称之识别序列。各种限制性内切核酸酶都有相应的识别序列。如，限制性内切核酸酶EcoRI的识别序列为GAATTC。 有一些限制性内切核酸酶虽来源不同，但有相同的识别序列，这样的限制性内切核酸酶称为之同裂酶，如BamHI和BstI具有相同的识别序列GGATCC。 （3）限制性内切核酸酶的酶切位点 DNA在限制性内切核酸酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二脂键断开的位置被称为酶切位点，用表示。限制性内切核酸酶在DNA上的酶切位点一般是在识别序列内部，如GGATCC。 DNA分子经限制性内切核酸酶酶切产生的末端因所用的酶不同而不同。两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键端开的位置如果是交错的，产生的DNA片段末端的一条链多出1至几个核苷酸，这样的末端称为粘性末端。DNA片段末端5端比3端长的称为5粘性末端,3端比5端长的称为3粘性末端。如果两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断裂后产生的DNA片段末端是平齐的,称为平末端。不管是粘性末端还是平末端,5端一定是-P基团，3端一定是OH基团。 有些限制性内切核酸酶虽然识别序列不同，但酶切DNA分子产生的DNA片段具有相同的粘性末端，这样的一组限制性内切核酸酶称为同尾酶。 二、特异性DNA片段的PCR扩增 1983年体外扩增DNA片段的方法产生，即聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)。采用这种方法，在反应系统中只要有一个待扩增的DNA拷贝，在短时间内就能扩增出大量拷贝数的待扩增DNA片段，可满足用于常规方法的DNA检测和DNA重组。 （1）PCR基本原理 PCR是模仿细胞内发生的DNA复制过程进行的，以DNA互补链聚合反应为基础，通过靶DNA变性、引物与模板DNA(待扩增DNA)一侧的互补序列复性、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，产生待扩增的特异性DNA片段。一般反应过程是：反应系统加热至90-95，双链DNA变性成为两条单链DNA（变性），作为互补链聚合反应的模板；降温至37-60，使两种引物分别与模板DNA链链的3一侧的互补序列杂交(复性或退火)；升温至70-75，耐热性DNA聚合酶催化引物按5'3'方向延伸合成模板DNA链的互补链（延伸）。重复以上过程，经过25-30次循环，就可以出现随待扩增的特异性DNA片段(图2-3)。 图2-3PCR扩增特异性PCR片段过程 （2）耐热性DNA聚合酶 耐热性DNA聚合酶的发现，使PCR扩增特异性DNA片段成为可能。由于这种酶在靶DNA变性的高温下仍保持活性，因此在PCR扩增特异性DNA片段的全过程中，只需一次加入反应系统中，不必在每次高温变性处理后再添加酶。目前用于PCR的耐热性DNA聚合酶主要有：TaqDNA聚合、Pwo酶等。 （3）PCR引物 PCR引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补，并能引导模板DNA互补链合成的一种脱氧核苷酸寡聚体，其3端必须具有游离的-OH。引物按预先设计用化学方法合成，其长短与PCR过程的特异性高低密切相关。一般来说，引物越长，特异性越高。为扩增特异性高的DNA片段，一般设计的引物由20-30核苷酸组成。 三、DNA片段的化学合成 （1）合成引物 除上述的PCR引物外，常用的还有核苷酸序列测序引物及合城cDNA的引物等。 （2）合成DNA寡聚核苷酸连杆 寡聚核苷酸连杆(linker)是一种按预先设计，化学合成的寡核苷酸片段。寡聚核苷酸连杆一般由8-12个核苷酸组成，以中线为轴两侧互补对称。其上有一种或几种限制性内切核酸酶的识别序列，使连接了寡聚核苷酸连杆的DNA片段经过这些限制性内切核酸酶酶切后，可以产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。如果连杆的两端已具有一种或两种限制性内切核酸酶酶切产生的粘性末端，可直接使两DNA片段连接，也称为衔接头或接头（adaptor）。 （3）合成基因片段 根据某基因测定的核苷酸序列，或者根据蛋白质氨基酸序列推导的核苷酸序列，可以用DNA自动合成议化学合成相应的基因片段。 一、DNA连接酶 DNA连接酶（DNAligase）能催化双链DNA片段紧靠在一起的3-OH与5-P之间形成磷酸二酯键（图2-4）。DNA连接酶主要有大肠杆菌（E.coli）DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。E.coliDNA连接酶只能催化双链DNA片段互补粘性末端之间的链接；T4DNA连接酶既可以用于双链DNA片段互补粘性末端之间的链接，也可催化双链DNA片段平末端之间的链接，但平末端之间链接的效率比较低。 图2-4DNA连接反应示意图 二、DNA片段之间的链接 （1）互补粘性末端片段之间的链接 链接反应一般可用E.coliDNA连接酶，也可以用T4DNA连接酶（图2-5）。待连接的两个DNA片段如果是同一限制性内切核酸酶酶切的，连接后仍保留原限制性内切核酸酶的识别序列。如果用两种同尾酶酶切的，虽然产生相同的互补粘性末端，可以进行有效的连接，但获得的重组DNA分子往往缺少了原来用于酶切的那两种限制性内切核酸酶的识别序列。 图2-5互补粘性末端片段之间的链接 （2）平末端DNA片段之间的链接 链接反应需用T4DNA连接酶。只要两个DNA片段是平齐的，不管是用限制性内切核酸酶酶切产生的，还是其他方法产生的，都可以进行连接（图2-6）。如果在两种不同限制性内切核酸酶酶切后产生的平齐末端DNA片段之间进行连接，连接后的DNA分子失去了那两种限制性内切核酸酶的识别序列。如果两个DNA片段的末端是用同一限制性内切核酸酶酶切产生的，连接后的DNA分子仍保留那种酶的识别序列，有的还出现另一种新的限制性内切酶的识别序列。 图2-5平齐末端片段之间的链接 三、DNA片段修饰后的链接 待连接的两个DNA片段经过不同限制性内切核酸酶酶切后，产生的末端不是互补的粘性末端，或者一个是粘性末端另一个是平末端。在这种情况下，链接之前必须对两个末端或一个末端进行修饰。修饰的方式主要是采用外切核酸酶将粘性末端修饰成平末端；采用末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）将平末端修饰成互补粘性末端；采用DNA聚合酶将粘性末端修饰成平末端。有时为了避免待连接的两个DNA片段自行连接成环形DNA，或自行连接成二聚体，可采用碱性磷酸酶使其中一个DNA片段5端-P修饰成-OH，即去磷酸化。 4、DNA片段加连杆或接头后连接 如果要连接既不具互补粘性末端又不具平末端的两种DNA片段，除了用修饰一种或两种DNA片段末端后进行连接的方法外，还可以采用人工合成连杆或接头。先将连杆连接到待连接的一种或两种DNA片段末端，然后用合适的限制性内切酶酶切连杆，使待连接的两种DNA片段具互补粘性末端，最后在DNA连接酶崔化下使两种DNA片段连接，产生重组DNA分子。若在DNA片段末端加的是接头，不需利用限制性内切酶酶切。 一、克隆载体 在转基因研究中，单独一个包括启动子、编码区和终止子的基因，或者组成基因的某个元件，一般不容易进入受体细胞，即使采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体内稳定维持。把能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA分子称为基因克隆载体(genecloningvector)。 作为基因克隆载体一般应该具备以下条件：在克隆载体合适的位置必须含有外源DNA片段组入的多克隆位点（multiplecloningsite），对于某种克隆位点来说，在载体上一般只有一个。一般能在携带外源DNA（基因）进入受体细胞后，或停留在细胞质中进行自我复制；或整合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA，随这些DNA的复制而同步复制；或自成染色体同其他染色体一样自行复制。必须含有供选择转化子的标记基因或报告基因。必须是安全的，不含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除选定的受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。 基因克隆载体示意图 二、基因工程常用质粒载体 质粒（plasmid）是一种存在于宿主细胞中染色体外的裸露DNA分子，一个质粒就是一个DNA分子。质粒含有复制起始位点，能在宿主细胞内进行自主复制，但不会像某些病毒那样进行无限制的复制，导致宿主细胞的崩溃。每个质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数，少数几个，多者上百。质粒DNA分子小的不足2kb,大的可达100kb以上，多数10个kb左右。 （1）大肠杆菌质粒载体 大肠杆菌质粒载体是一类应用广泛的克隆载体，含有大肠杆菌源质粒的复制起始位点，能够在转化的大肠杆菌中进行复制。 1）pBR322质粒载体 pBR322是一种典型的常用质粒载体。pBR322由大肠杆菌源质粒ColE1衍生的质粒pMB1为基础构建而成，含有ColE1的复制起始位点（Col-ori）,能在大肠杆菌细胞中进行高拷贝复制。含有选择标记基因Ampr和Tetr。Ampr基因区的Pst和Pvu的识别位点，Tetr基因区的Cla、Hind、BamH和Sal等的识别位点是常用的克隆位点。pBR322分子大小为4363bp，可以克隆10kb以下的外源DNA片段。 质粒载体pBR322 2）pUC18/19质粒载体 pUC18/19质粒载体具有pBR322的复制起始位点，含有选择标记基因Ampr和lacZ,并在lacZ区组装了多克隆位点(MCS)连杆,外源DNA片段插入MCS的任一克隆位点后，导致lacZ基因失活，可提供菌落蓝/白选择标记，并且插入MCS的外源基因可以在lac启动子调控下进行表达。pUC18与pUC19的差别只是MCS连杆上的克隆位点以相反的方向排列。 pUC18/19质粒载体 （2）农杆菌Ti质粒载体 根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时会引发植物产生肿瘤（冠瘿瘤），因次称此质粒为Ti质粒（tumorinducingplasmid）。 根癌农杆菌引发植物产生肿瘤 Ti质粒是一种双链环状DNA分子，其大小为200kb，但是能进入植物细胞的只是一小部分，约25kb，称为T-DNA（transferDNA）。T-DNA左右两边界(LB，RB)各有一个选择标记基因25bp的正向重复序列(LTS和RTS)，对T-DNA的转移和整合是不可缺少的，并且己证实T-DNA只要保留两端边界序列，即使中间的序列不同程度被任何一个外源DNA片段所替换，进入植物细胞后仍可整合到植物基因组中。根据Ti质粒的这个性质，近年来构建成含LB和RB的质粒载体，已被广泛地用于植物的基因转移。 Ti质粒克隆载体示意图 （3）T克隆载体 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3端加上一个突出的碱基A。T克隆载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3端带有一个突出的T。T克隆载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到T克隆载体中，形成含有目的片断的重组载体。 pBM19-T克隆载体示意图 病毒主要由DNA(或RNA)和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞，利用宿主细胞的DNA(或RNA)复制系统和蛋白质合成系统进行DNA(或RNA)的复制和外壳蛋白的合，实现病毒颗粒的增殖。 一、噬菌体载体 （1）噬菌体载体 噬菌体由DNA(DNA)和外壳蛋白组成（图a），对大肠杆菌具有很高的感染能力。DNA在噬菌体中以线状双链DNA分子存在，全长48502bp。其左右两端各有12个核苷酸组成的5'突出粘性末端(cohesiveend)（图b），而且两者核苷酸序列互补，进入宿主细胞后，粘性末端连接成为环状DNA分子，将此末端称为cos位点(cohesiveendsite)。噬菌体能包装DNA原长75%-105%的DNA片段，36.4-51kb，并且DNA上约有20kb时区域对噬菌体的生长不是绝对需要的，可以缺失或被外源DNA片段取代。 噬菌体示意图 构建入噬菌体克隆载体的策略是：用合适的限制性内切核酸酶切去DNA上的部分或全部非必需区，相应保留这种酶的1个或2个识别序列和切割位点作为克隆位点，并用点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的这种酶的识别序列失效，避免外源DNA片段插入必需区。若有必要可在非必需区组入选择标记基因。构建的DNA载体不应小于36.4kb。由此构建成噬菌体载体。 构建噬菌体载体的示意图 （2）cosmid载体 由于噬菌体载体本身必须大于36.4kb，限制了允许克隆的外源DNA片段。研究发现只要保留DNA两端各不少于280bp的片段，并且该片段内含有cos位点及与包装相关的核苷酸序列；当插入外DNA片段后总长大于36.4kb，小于51kb；这样的重组DNA分子就能进行有效包装和转导受体细胞。根据这一性质构建了cosmid载体。cosmd载体是一种环状双链DNA分子，由质粒DNA和部分DNA组成。 cosmid载体示意图 质粒部分含有大肠杆菌源质粒复制起始位点、克隆位点和选择标记基因等基本构件，可以像质粒载体一样承载外源DNA片段，转化大肠杆菌受体细胞，并在其中自行复制和增殖。DNA部分允许重组DNA分子进行有效包装和转导受体细胞。但是由于cosmid载体不具噬菌体溶菌生长途径，因此不产生子代噬菌体。 cosmid载体一般在10kb以下，能承载比较大（40kb左右）的外源DNA片段，被广泛地用于构建基因组文库。 二、植物病毒克隆载体 植物病毒种类繁多，已用于构建植物载体的有双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV），单链DNA病毒番茄金黄花叶病毒(TGMV)、非洲木木薯花叶病毒(ACMV)、玉米线条病毒(MSV)、小麦矮缩病毒(WDV)，以及大麦条纹花叶病毒(BSMV)、番茄丛矮病毒(TBSV)、马铃薯X病毒(PVX)、烟草花叶病毒(TMV)等。 构建植物病毒克隆载体的基本策略是对病毒DNA(包括RNA反转录的DNA)进行加工，消除其对植物的致病性，保留其通过转导或转染能迸入植物细胞的特性，使其携带的目的基因能导入植物细胞。由于植物病毒克隆载体的应用局限性比较大，因此植物病毒载体应用并不普遍。 利用CaMV感染植物后能启动35SRNA转录的强启动子，构建含35S启动子的高效表达载体（图2-16），能启动目的基因在植物细胞中进行高效的表达。 35S启动子示意图 三、动物病毒克隆载体 由于动物转基因不能应用质粒克隆载体，因此动物病毒克隆载体在动物转基因研究中起着更重要的作用。目前，用于构建克隆载体的动物病毒有痘苗病毒(poxvirus),腺病毒(adenovirus)、杆状病毒(bacuovrus)、猿猴空泡病毒(simianvacuolatingvirus)和反转录病毒(retrovirus)等。 一、人工染色体载体 质粒载体、病毒 (噬菌体) 克隆载体各具优点，但它们能承载的外源DNA片段大小一般不超过50kb。显然这些载体限制了对具有庞大和复杂功能的人和高等动植物基因组的研究。因此，伴随结构基因组学和功能基因组学研究的发展，以及实施人类基因组计划和动植物基因组计划的需要，能承载大片段DNA的人工染色体载体应运而生，并且发展迅速。人工染色体是指能在宿主细胞中稳定地复制并准确传递给子细胞的人工构建的染色体。由于人工染色体能承载100kb以上的DNA大片段，因此又称为大DNA片段克隆载体。目前已构建的人工染色体从其结构来分可分为两类，即线形的人工染色体和环形的人工染色体。 线形的人工染色体如同真核生物的染色体一样，必须含有染色体的结构元件端粒 (telomere)、着丝粒(centromere)和复制起始区(origin of replication) 。端粒对染色体DNA两个末端起封口和保护作用。着丝粒负责染色体向子细胞的传递。复制起始区的功能是负责启动染色体的复制，使构建的人工染色体能在宿主细胞中稳定地复制并准确传递给子细胞。属于这一类的人工染色体有酵母菌人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)、植物人工染色体（plant artificial chromosome, PAC）、人类人工染色体(human artificial chromosome, HAC) 和哺乳动物人工染色体(mammal artificial chromosome, MAC)等。 环形的人工染色体则不需要端粒和着丝粒，但必须含有合适的复制起始区，使构建的环形人工染色体能在宿主细胞内稳定地复制，并在细胞分裂过程中分配到子细胞中。属于这一类的人工染色体有细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)、源于噬菌体P1的人工染色体(P1 derived artificial chromosome, PAC)、双元细菌人工染色体（binary BAC, BI-BAC)、可转化人工染色体(transformation competent artificial chromosome, TAC)。 不管是哪一类人工染色体，作为DNA片段克隆载体，还必须具备合适的克隆位点和选择标记基因等克隆载体必备的元件。 2、基因表达载体 作为基因表达载体，在构建的载体中除了一般克隆载体必备的构件外，在插入目的基因的克隆位点上、下游，还应有供目的基因转录mRNA必备的启动子和终止子，与目的基因在受体细胞内的表达强弱密切相关。其中启动子尤为重要，在构建表达载体时常用的启动子有诱导启动子和组织特异性启动子，构建的载体相应称为诱导型表达载体和组织特异性表达载体。 （1）诱导型表达载体 诱导型表达载体指载体中的启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或较高转录活性的表达载体。外源基因处于这样的启动子下，必须在合适的诱导条件下才能表达。采用这种表达载体获得的转基因生物便于人工控制，即使进入自然环境中，由于不存在合适的诱导条件，不能表达外源基因产物，因此不易导致环境污染和影响生态系统的平衡。可以认为这是一类较安全酌基因表达载体。并且鉴于诱导表达载体能人为地控制基因时空的表达，将为基因治疗的临床应用及基础研究提供良好的手段。目前用作诱导型的启动子有二价金属离子诱导启动子、红光诱导启动子、热诱导启动子和干旱诱导启动子，等等。 （2）组织特异性表达载体 在较高等的真核生物中，有一类特殊的启动子只有在一定的组织中才能调控其下游的基因进行有效的表达。选用这样的启动子可以构建一系列组织特异性表达载体，为研究动植物发育和人类基因治疗等提供有效的手段。目前，已构建的组织特异性表达载体有乳腺组织特异性表达载体、肿瘤细胞特异性表达载体、花药特异性表达载体和种子特异性表达载体。 在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因称为目的基因。目的基因一般是结构基因，也就是能转录和翻译出多肽 （蛋白质）的基因。 一、目的基因的来源 目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基因组，是获得目的基因的主要来源。原核生物的染色体基因组也是目的基因来源的候选者。线粒体基因组、叶绿体基因组，以及质粒基因组和病毒 (噬菌体)基因组也可从中获得有特殊需要的目的基因。此外，化学合成的DNA也是目的基因的来源之一。 二、分离目的基因的途径 根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个基因编码区，或者包含启动子和终止子的功能基因；可能是一个完整的操纵子或由几个功能基因、几个操纵子聚集在一起的基因簇；也可能只是一个基因的编码序列，甚至是启动子或终止子等元件。常采用的方法主要有酶切直接分离法、PCR扩增法、构建基因组文库或cDNA文库分离法、化学合成法等。 （1）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离月的基因 为了获得己克隆在载体中的目的基因，只要根据目的基因两侧的限制性内切核酸酶识别序列，用适当的限制性内切核酸酶酶切，一次就可获得目的基