最新BrdU-免疫荧光、免疫组化-增值检测方法.docx

精品资料BrdU-免疫荧光、免疫组化-增值检测方法.BrdU免疫荧光取第三代细胞接种于六孔板中，在接种的基础培养基中加入BrdU(终浓度为20mol/ml), 3d后将细胞爬片行BrdU免疫荧光染色，倒置荧光显微镜观察。免疫荧光检测步骤如下：1）固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min；2）变性：将固定好的细胞爬片PBS洗3次，每次5 min（摇床转速60）；2 mol/L的HCl室温下变性60 min；3）中和：0.1 mol/L的硼酸钠（PH8.5）中和10 min, PBS冲洗10 min, 3次；4)孵一抗：用1% BSA溶液稀释抗BrdU抗体至终浓度为6g/ml，在细胞爬片上滴加150-300L，37湿盒中孵育60 min；将孵好一抗的细胞爬片PBS洗10min，3次；5)孵二抗：用1% BSA溶液按1:600稀释FITC结合的goat anti-rabbit二抗，37湿盒中孵育60 min，将孵好二抗的细胞爬片PBS洗3次，每次10 min，注意避光；6)染核：每张爬片200l浓度1ug/ml的DAPI溶液浸染3 min，PBS洗2次，每次5 min；7)封片：中性树胶封片，荧光显微镜观察。BrdU免疫组化（1） 将制作的5m厚的石蜡切片于60烘箱中烤片24 h。（2） 二甲苯（、）各10 min。（3） 梯度乙醇水化各5 min，100%、95%、85%、75%乙醇。（4）（4） 流水冲洗5 min。（5）（5） 3%H2O2室温避光孵育20 min，阻断内源性过氧化物酶的活性。（6）（6） PBS浸泡5 min，3次，在低速摇床上振摇水洗。（7）（7） 加入0.1%胰酶抗原修复20min。（8）（8） PBS水洗2-3次，各5 min。（9）（9） 山羊血清室温下封闭20min。（10）（10） 封闭后倒去血清，勿洗，滴加按说明书稀释的一抗，4过夜或者37两小时。（11）（11） PBS冲洗，5 min×3次。（12）（12） 滴加1：100稀释的二抗，37孵育30 -60min，PBS冲洗，5 min×3次。（13）（13） DAB显色，在显微镜下掌握染色的程度（一般约3-8s，无需看到组织变黄，组织变黄一般大部分已假阳性），流水冲洗5 min。（14）（14） 苏木精复染2 min，1%盐酸酒精分化10-20s。（15）（15） 脱水、透明，中性树胶封片。（16）（16） 显微镜下观察，采集图片。检验细胞增殖的检验方法：BrdU标记法 1、细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35ml培养皿中（内放置一盖玻片），培养1天，用含0.4FCS培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于G0 期。2、终止细胞培养前，加入BrdU（终浓度为30g/L），37，孵育40min。3、弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。4、甲醇/醋酸固定10min。5、经固定的玻片空气干燥，0.3H2 O2 -甲醇30min灭活内源性氧化酶。6、5正常兔血清封闭。7、甲酰胺100，5min变性核酸。8、冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50），阴性对照加PBS或血清。（17） 9、按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI）。