微生物工程工艺原理实验讲义.doc

如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流微生物工程工艺原理实验讲义【精品文档】第 21 页实验一 酒精连续发酵实验一、 实验目的1. 熟悉和了解连续发酵过程前发酵、主发酵、后发酵的酒精发酵动态。2. 掌握酒精连续发酵过程中各种参数的变化规律。3. 通过实验分析初步掌握酒精发酵的工艺技术。4. 加强综合分析问题，解决问题和动手能力的训练和培养。二、 实验原理酒精发酵一般采用间歇式和连续式两种工艺方法。间歇式发酵从接种至酒精发酵结束全过程均在一个发酵罐中完成。酵母菌种的生长和代谢是在糖分不断下降，酒精浓度不断增加的过程中进行的。这种情况会对酵母的生长代谢产生抑制作用，使酒精发酵率降低。连续发酵工艺可以克服间歇发酵的缺点和不足。特别是多级连续发酵工艺，其发酵的每一阶段是在不同的发酵罐中进行，根据连续发酵的原理，对整个连续发酵系统中的每一个发酵罐来说，罐中的基质浓度，细胞浓度，酒精浓度，PH、发酵温度等因素都是稳定的。这样对酵母的生长代谢有利，其发酵能力增强，发酵率也相应提高。在酒精连续发酵系统中，一般前面两个发酵罐称为流加罐或酵母增殖罐，酵母菌和新鲜稀糖液先进入这两罐，然后自然流入下一罐，主要控制好稀糖液流加速度使发酵达到平衡。这样酵母菌在1#和2#发酵罐中生长和代谢都十分旺盛，使连续发酵系统一开始就处于主发酵阶段，大大缩短了发酵周期，与间歇发酵比较提高了设备利用率。根据连续发酵动力学原理、酒精连续发酵服从于单分子反应定律，即糖的发酵速度常数可用下式表示：上式中：K发酵速度常数t发酵时间S0发酵前醪液中的糖浓度S发酵t时间后醪液中的糖浓度在连续发酵过程中，发酵时间可用下式表示： (小时)上式中：f发酵醪的流速（米3/小时）v发酵罐中所装醪液的体积（米3）发酵罐中醪液的体积是指酒精浓度达到最高值前所有罐中发酵醪的体积。例如有7个发酵罐组成的发酵系统，当测定第5号罐时酒精浓度已达到最高值，后两个罐已不再增加酒精浓度，应以15号的醪液总体积为计算依据，67号罐的醪液体积可不计算。在稳定状态下，连续发酵罐中菌体的比生长速率为：式中：比生长率，其余参数同前。发酵液的稀释度为：式中：D 发酵醪液稀释度，其余参数同前。三、 实验装置本实验采用单浓度流加多级连续发酵工艺，实验装置采用多个小型发酵罐串连而成，发酵醪采用下部进料上部出料的流动方式，这样能减少发酵醪在罐中的短路现象，以保证发酵醪先进先出的工艺要求。其工艺流程图1如下：四、 实验方法(一) 酵母菌种的扩大培养原菌试管种 à 新鲜斜面试管活化培养 à 液体试管培养 à 大三角瓶培养 à 酒精连续发酵实验。1. 原菌试管种选用糖密原料酒精发酵常用菌种有古巴I，古巴II，F396等菌种，可根据实际情况选用。2. 新鲜固体斜面培养基的配制固体斜面培养基用10BX的米曲汁或麦芽汁适量，加入2%的琼脂在电炉上煮溶，趁热分装试管，每支试管装液量约10ml，塞好棉塞以1kg/cm2的压力杀菌20分钟，取出放成斜面。接入原菌，置恒温箱内保湿30培养34天后放入冰箱备用。3. 液体试管培养在试管中装入约10ml左右的米曲汁或麦芽汁，塞好棉塞以1kg/cm2的压力灭菌20分钟，取出冷却至30左右，接入新鲜斜面种，以30恒温培养24小时。4. 菌种大三角瓶培养用三个500ml三角瓶分别装入加了营养盐的稀糖液约350ml（稀糖液浓度为1822BX，PH 4.04.5）以1kg/cm2的压力灭菌20分钟，取出冷却至30，每个三角瓶接入2支液体试管菌种，以30恒温培养1420小时。(二) 酒精连续发酵1. 发酵稀糖液的制备原糖密（8590BX）à 称取4000克 à 倒入桶中 à 加入、（NH4）2SO4 16克、浓H2SO4 16ml à 稀释至55BX、PH4.5 à 静置澄清28小时 à 取上清液 à 加水稀释至1822BX à 加热至100 à 冷却备用。 2. 发酵条件及控制发酵稀糖浓度取1822BX、发酵Ph4.04.5、糖液流加速度约0.81.2升/小时、酵母数控制在1.01.2亿/ml，发酵温度为3032，发酵时间约30小时，成熟醪含酒份约8%（V），残总糖控制为0.35%左右。五、 分析检测项目及方法(一) 发酵液PH值的测定PH值的测定可用仪器和试剂等方法进行。用仪器测定准确度较高，科研中常用，作为标准测定方法。用PH试纸测定虽不及仪器准确，但用法简便经济，基本能满足生产要求。两种测定方法如下：1. 电位测定法（1） 原理图2 用玻璃电极测定PH值示意图如图2所示，当指示电极（玻璃电极）和参比电极（甘汞电极）浸在同一溶液中时，便形成一个完整电池。此时可准确测出该电池和电动势、此电动势的大小与溶液的PH值有直接关系。用玻璃电极测定溶液的PH值的基础在于：如果有一个传导的玻璃薄膜介于两个具有不同PH值的溶液之间，则跨越这个玻璃薄膜就产生一个电势差。它可通过在每种溶液中各放一支具有已知恒定电势的参比电极（一般玻璃电极的内参比电极为AgAgCl电极，外参比电极饱和甘汞电极）并测得这两个电极间的电势差而求得，如图所示跨越两个电极间的电势将作为两种溶液中氢离子活度a1和a2比值的变化函数，在25时有如下关系：为了测定未知溶液的PH值，氢离子活度a2就保持恒定，一般在玻璃电极泡内放置0.1N Hcl溶液的a2就恒定了，而a1为待测溶液的氢离子活度，可用下式表示。此式中K是一个新的常数，它包含了a2的对数函数，K值可通过测定一个氢离子活度和已知溶液的电势E而求出。因此，测定原电池的电动势，便可求出未知溶液的PH值。（2） 测定方法以PHS3型酸度计为例，其测定方法如下： 仪器使用前的准备A. 首先把仪器和搅拌器的电源插头接在220V的交流电源上，在搅拌器的电极杆上装上电极架，并将电极夹装在电极架上。B. 放出“测量”开关，按下“PH”或“mV”按键（即接通电源），使仪器颈预热120分钟，然后进行标定。C. 在使用仪器测定被测溶液之前，必须先标定，一般来说在连续使用时，每天标定一次已能达到要求。（如连续使用该仪器、不必关闭电源，这样仪器的稳定性更好），其标定步骤如下：I. 放开“测量”开关，按下“mV”键。II. 调节“零点”电位器读数在±0之间。III. 按下PH键。IV. 先用蒸馏水清洗电极，再用已知PH值的缓冲液淋洗，然后将电极插入此已知PH值的缓冲液中（如PH = 4），调节“温度”调节器，使所指示的温度与溶液温度相同，开动搅拌器将溶液搅拌均匀。V. 按下“测量”开头，调节“定位”调节器，使仪器计数与该缓冲液相同（如PH = 4）。到此仪器的标定已完成，“定位”调节器不应再变动，即可测定未知溶液的PH值。 溶液PH值的测定I. 放开“测量”开关，“定位”保持不变。II. 用温度计测出被测溶液的温度。III. 调节“温度”调节器，使其指示在被测液的温度值上。IV. 用蒸馏水清洗电极、用滤纸吸干（或用被测液淋洗）插入被测溶液中，开动搅拌器，将溶液搅拌均匀。V. 按下测量开关，读出该溶液的PH值。VI. 测量完毕，关闭各开关、截断电源，并清洗电极。（3） 测定注意事项I. 酸度计应放置在坚固、干燥和无腐蚀性气体的地方。II. 在测定酸性溶液时，应用PH值低于7.0的缓冲液定位，测定碱性溶液时用高于PH值7.0的缓冲液定位。III. 玻璃电极球如有裂纹或老化（久放二年以上）则就更新电极，否则反应缓慢，甚至造成较大的测量误差，新的电极在使用之前用蒸馏水浸泡24小时。IV. 仪器的输入端（即玻璃电极插口）必须保持清洁，不使用时将接续器插入，以防止灰尘及高温浸入，在环境温度较高的场所使用时，应把电极插入口用干净纱布擦干。V. 玻璃电极球泡很薄，注意勿与硬物碰撞。玻璃电极和甘汞电极在使用时，必须注意内电极与球泡之间及内电极和陶瓷芯之间有否气泡停留，如有则必须除掉。VI. 该仪器采用场效应晶体管和PNOS集成电路，它很容易击穿，因此检修时应注意不要用电烙铁直接焊接场效应晶体管的各极和PNOS集成电路，如有必要，应将电烙铁的电源拨除后才进行焊接。（4） 标准缓冲溶液的配制 PH值4.0缓冲溶液：称取在115下干燥的G.R级邻苯二甲酸氢钾10.21克，用重蒸蒸馏水溶解，移入1000ml容量瓶中，稀释至刻度。此缓冲液在15时，其PH值为4.0。 PH值6.88缓冲溶液：称取在115下干燥的G.R级磷酸二氢钾3.39克和G.R级磷酸氢二钠3.55克，以重蒸蒸馏水溶成1000ml，此缓冲液在15时PH值为6.9。 PH值9.27缓冲溶液：称取G.R级硼砂（不能烘）3.81克，以重蒸蒸馏水溶成1000ml，此缓冲溶液在15时PH值为9.27。（5） 缓冲溶液PH值与温度关系对照表温度 溶液邻苯二甲酸盐中性磷酸盐硼酸盐54.016.953.39104.006.929.33154.006.909.27204.006.889.22254.016.869.18304.026.859.14354.036.849.10404.046.849.07454.056.839.04504.066.839.01554.086.848.99604.106.848.962. PH试纸比色法每一种指示溶液都具有一定的变色范围，利用这个变化可测定试液的PH值，PH试剂是由各种指示溶液浸制而成的，将试液滴在PH试剂上便呈现出颜色，与标准色样比较就可以得出试液的PH值。酒精发酵液可用PH 3.85.4范围的精密试纸测定，测定的方法是用干燥洁净的摄子夹取精密试纸的一条浸入稀糖液中，半秒钟后取出与标准色板比较，即得稀糖液的PH值。注意PH试纸在日光下与空气中以及遇到酸性物质和二氧化碳等气体时，均能使它变质失效，故PH试纸宜在密闭干燥处保存，测定前切使试纸受潮。(二) 发酵液酸度的测定1. 酸度的定义酸度以中和100克糖液所消耗0.1N氢氧化钠溶液的毫升数表示。2. 试剂配制（1） 0.1N氢氧化钠溶液称取4克氢氧化钠，溶于水并稀释至1000ml。并对该氢氧化钠溶液进行标定。标定方法如下：准确称取0.4克邻苯二甲酸氢钾（预先于120烘2小时）置于250ml角瓶中、加约50ml水溶解，加2滴1%酚酞指示剂，以0.1N氢氧化钠溶液滴定至微红色，记下所耗0.1N氢氧化钠的毫升数。计算如下：式中:W邻苯二甲酸氢钾称取量（克）V消耗氢氧化钠溶液的体积（ml）204.2邻苯二甲酸氢钾的分子量（克）（2） 1%酚酞指示剂准确称取1克酚酞、溶于100ml 95%酒精中。（3） 0.1%溴龙涏香蓝指示液准确称取0.1克溴龙涎香蓝，加50%的中性酒精溶成100ml后过滤备用。3. 酸度的测定方法称取试样10克用中性蒸馏水（PH±0.2）溶解至100ml（用100ml容量瓶）作为检液。在250ml三角瓶中加入蒸馏水150ml、加入0.1%溴龙涏香蓝指示液23滴，用0.1N氢氧化钠溶液滴定至中性反应（浅蓝色，PH±0.2），此次滴定耗用0.1N氢氧化钠的量不必记录，然后加入检液10ml（相当于1克试样）混合后，加入23滴定溴龙涏香蓝指示液，继续用0.1N氢氧化钠滴定至中性反应（即黄绿色），并记录此次滴定所耗用0.1N氢氧化钠标准溶液的毫升数。滴定终点判断不明晰时、可按如下外指示剂法确定。在白瓷板上的数个孔内分别滴入溴龙涏香蓝指示液一滴，并于板中心的一个孔内加入中性蒸馏水0.5ml作为比色标准（草绿色）。在滴定快到终点时，每滴定23滴0.1N氢氧化钠后，即用玻璃棒带上一滴检液置于瓷板上的一个孔内，使其与指示液混合显色以判断终点。呈黄色表示酸性，继续滴定。呈蓝色表示碱性，即滴定过量应重做测定。呈草绿色表示中性，即达到终点。4. 结果计算式中：V滴定时耗用0.1N氢氧化钠标准溶液的体积。F0.1N氢氧化钠标准溶液的当量系数。 表示1克试样换算成100克试样的倍数。(三) 糖分测定1. 原理糖份采用兰因艾农（LaneEynon）恒溶法进行测定。首先将试样进行处理，使用中性醋酸铅和脱铅剂将试样中的可还原性的非糖份及钙盐等杂质清除干净，然后用盐酸使双糖转化为还原性的单糖。单糖在一定碱度的裴林氏溶液中使二价铜还原为一价铜，从而求出糖份含量。（1） 裴林氏甲乙液混合时生成可溶性的酒石酸钾钠铜络合物和硫酸钠。COOK COOK| |CHOH CHO| |CuSO4 + 2 NaOH + CHOH à CHOCu + Na2SO4 + 2 H2O| |COONa COONa（2） 酒石酸钾钠铜络合物中二价铜是一个氧化剂，反应时能释放出新生态氧，使二价铜还原为一价的亚铜。COOK COOK| |CHO CHOH| |2 CHOCu + 2 H20 à 2 CHOH + Cu2O + O| |COONa COONa (红色)（3） 还原糖的氧化过程O COOH COOH CH | +O +2OR4 à R4 à R4 + H2O| | |CH2OH CH2OH COOH R=CHOH(葡萄糖)CH2OH COOH COOHC=O O| +O +3OR3 à R3 + HCH à R3 + H2O| | |CH2OH CH2OH COOH(果糖)反应过程中每分子蔗糖耗用14个铜原子（因为2个铜原子相当一个氧原子），即每分子还原性物质耗用7个铜原子，变即裴林氏混合液10ml内所含的铜量应耗用0.0357克还原物质。但实际滴定时则随溶液的碱度不同而变化。如滴定总容量为20ml，则耗用0.0504克还原物质（即100分子单糖耗用496个铜原子），如滴定总容量为54ml，则耗用0.0522克还原物质（即100分子单糖耗用479个铜原子）。这说明还原物质的氧化程度随着反应条件而变化的，因此要严格遵守各项实验规定、才能获得准确的结果。（4） 反应终点用次甲基蓝指示液显示，因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故二价铜全部还原为一价铜后，过量一滴还原糖立即把次甲基蓝还原，使溶液蓝色消失以示终点。其反应式如下：2. 试剂配制（1） 中性醋酸铅溶液称取中性醋酸铅250克（Pb（C3H3O2）2·3H2O），加水500ml，搅拌使之充分溶解，静置、倾取上层清液，沉淀、过滤，在滤液中加入浓醋酸使呈中性或微酸性（用石蕊试纸检测）。再加新鲜蒸馏水稀释至54BX（比重1.25）。（2） 脱铅剂称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）140克和草酸钾（K2C2O4·H2O）60克，用少量蒸馏水分别溶解，合并后稀释至2000ml。（3） 裴林氏甲乙液甲液：称取分析纯硫酸铜（CuSO4·5H2O）30克，次甲基蓝0.10克，用蒸馏水溶解后稀释至2000ml。乙液：称取分析纯酒石酸钾钠100克，分析纯氢氧化钠108克，分析纯亚铁氰化钾（黄血盐）8克，用蒸馏水溶解后稀释至2000ml。（4） 0.1%标准葡萄糖溶液准确称取已烘干的无水葡萄糖4克（用1/10000天平称重，无水葡萄糖预先在烘箱中以110烘干至恒重，时间约2小时），用少量蒸馏水溶解，加入20ml浓盐酸防腐，并用蒸馏水定容至4000ml。（5） 20%氢氧化钠溶液（称取80克NaOH加水溶解并稀释至400ml。）（6） 20%HCl溶液（量取80ml浓HCl缓慢倒入320ml水中）。3. 总糖的测定（1） 总糖检液的制备准确吸取试样10ml，用蒸馏水约50ml转移入100ml容量瓶中，加中性醋酸铅溶液35ml，加蒸馏水至刻度。若泡沫过多难以定容，可加数滴酒精或丙酮除去泡沫。摇匀，以滤纸过滤至250ml三角瓶中，最初的10ml滤液洗涤三角瓶后弃去。用移液管准确吸取滤液50ml于100ml容量瓶中，加脱铅剂12ml，摇匀，静置34分钟，沿瓶壁加12滴脱铅剂，如不再生成浑浊方证明脱铅剂已足够。（过量的铅会影响分析结果偏低）。加蒸馏水至刻度，摇匀，过滤至250ml三角瓶中，最初约10ml滤液洗涤三角瓶弃去。吸取滤液50ml于100ml容量瓶中，加浓盐酸3ml，在6970水浴中转化8分钟，冷却后在冷水浴中用20%氢氧化钠溶液中和至中性，加水至刻度、即为测定总糖的检液。（2） 总糖测定方法 裴林氏液的标定（即空白滴定）吸取斐林氏甲、乙两液各5ml于150ml小三角瓶中，预加0.1%的标准葡萄糖液适量（约89ml），加蒸馏水10ml,（以煮沸时裴林氏液仍呈现蓝色者为合适。如裴林氏液变为无色，说明所加糖已过量，应重做）。煮沸2分钟后，继续滴加0.1%葡萄糖液至蓝色刚变为无色为终点。继续滴加的操作，应在1分钟内完成。记录所耗标准葡萄糖液的总毫升数A。 定糖I. 准确吸取裴林氏甲、乙液各5ml放入150ml三角瓶中。II. 用吸管吸取1ml检液加入三角瓶中，从滴定管加入0.1%标准葡萄糖液约10ml。III. 置电炉上加热煮沸2分钟（如发现蓝色消失，则表示检液过浓或标准葡萄糖液加过量，应予适当的稀释或取较少的检液重做）。IV. 在沸腾下继续滴加0.1%的标准葡萄糖液至蓝色刚消失为终点。此操作必须在1分钟内完成。记录所耗标准葡萄糖的总毫升数为B。（3） 结果计算以上测定取得准确结果后，可按正式计算检液中的总糖含量。式中：A空白滴定所耗标准葡萄糖液总毫升数。B测定检样时所耗标准葡萄糖液总毫升数。C标准葡萄糖液的体积百分浓度。n检液的稀释倍数。（）V滴定时所吸取检液的毫升数。4. 还原糖测定（1） 检液的制备准确吸取试样10ml,用蒸馏水约50ml转移入100ml容量瓶中，加中性醋酸铅溶液35ml，加蒸馏水定容至刻度，若泡沫过多难定容，可加数滴酒精或丙酮除泡沫、摇匀，用滤纸过滤至250ml三角瓶中，最初约10ml滤液用于洗涤三角瓶后弃去，继续过滤。用移液管准确吸取滤液50ml于100ml容量瓶中，加脱铅剂12ml，摇匀，静置34分钟，沿瓶壁滴加12滴脱铅剂，如不再生成浑浊，证明胶铅剂已足够。（过量的铅会影响分析结果偏低）。加蒸馏水至刻度，摇匀过滤。用初滤液约10ml洗涤三角瓶弃去。准确吸取滤液50ml于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容于刻度，摇匀即为还原糖检液。（2） 还原糖检测方法还原糖的测定方法与总糖的测定方法相同。（3） 结果计算还原糖的结果计算与计算公式与总糖测定的计算的方法和公式相同。5. 蔗糖含量测定(四) 发酵液的微生物检查1. 酵母形态的观察观察酵母的形态，主要是为了辨别酵母是处于生长旺盛期，还是呈衰老或死亡状态。为生产提供调控依据。酵母细胞形态要求饱满健壮，无变形和大小不均匀现象，细胞质均匀浓稠，且不被美蓝等染色剂染色，空泡少，细胞膜薄，用碘液作肝糖染色时，大多数被当成红褐色。（1） 仪器和试剂 显微镜 0.5%次甲基蓝染色剂称取0.5克次甲基蓝，加蒸馏水100ml，加热溶解，贮存于棕色试剂瓶中。（2） 检查方法在检查酵母形态时，先取检液一滴于干洁之载玻片上、加上盖玻片，去除空气泡，用吸水纸去多余在外的液体，置显微镜下，先用低倍镜头100200倍，找出细胞分布均匀之视野，然后转用高倍镜头8001000倍观察，凡酵母细胞周围尚未发芽，细胞膜较薄而透明，细胞内的原生质亦透明，即尚未成为颗粒状态，细胞核较难看出则为幼龄酵母，若细胞成单体，或周围已经出芽，细胞膜较厚，原生质中偶有空泡，细胞膜原生质核及细胞均匀充分发育，可以看到细胞内容物成为颗粒状态为成年酵母，若细胞膜呈绉缩状，原生质收缩，成粒状的组织，则为老年酵母，若细胞膜开始分裂，发生自溶，细胞收缩，个体小，酵母蛋白质能屈折光线，颗粒已溶解消失，可被染色剂染色者则为死亡或衰老细胞。2. 酵母细胞数的测定酵母数是指每1ml发酵液中所含酵母的个数。（1） 仪器与试剂 血球计、细胞计数器 10%稀硫酸溶液量取浓硫酸30ml，慢慢注入300ml水中，冷却后，再加水稀释至500ml。（2） 操作步骤 检片制备吸取待检液1ml放入试管内，然后加入9ml 10%的稀硫酸，共计10ml，将样品充分摇匀后，用胶头吸管取一滴于血球计上，盖上盖玻片，用双手将其来回推动，使其紧密贴紧为止，观察血球计与盖玻片之间不得有空气泡，否则重做，静置23分钟，置显微镜下先用低倍镜100200倍观察，然后改用450倍观察。 检查方法由于血球计盖上盖玻后的容积是一定的，故可根据在显微镜下观察到的细胞数来计算单位体积的微生物总数。血球计通常是一块特别的玻璃片，玻璃片上有四条槽而构成的三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽而隔成两半，每个半边上各刻有一个方格网，每个方格网共分九大格，其中间的大大格（又称为计数室）常用于微生物的计数，血球计的构造如图3所示。计数室的刻度一般有两种，一种是大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格。另一种是大方格分成25个中方格，每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室中哪一种结构，它们都有一个共同特点，即每一个大方格都由16 X 25 = 400 个小方格组成。每一大方格边长为1毫米，则每一个大方格面积为一平方毫米，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1毫米，所以每个计数室（即大方格）的体积为0.1立方毫米。左上：正面图左下：侧面图右：放大后的方格网（计“红1”红5”方格中的菌数）图3 血细胞计数板（血球计）在计数的时候，通常数5个中方格的总菌数，求得平均值。再乘上16或25就得出一个大方格的总菌数，然后再换算成1ml发酵液中的总菌数。计数时，连线上的细胞只计右线与下线，而不计左线与上线，芽胞大于母细胞1/2者作两个细胞计，未超过1/2都作一个细胞计。现以一大方格分25个中方格的血球计为例进行计算。设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么一个大方格中的总菌数（即0.1立方毫米中的总菌数）为A / 5×25×B因为1毫米 = 1立方厘米 = 1000立方毫米所以，1毫米中的总菌数 = A / 5×25×10×1000×B = 50000×A×B （个）同理，每个大方格分16个中方格时，设五个中方格中的总菌数量为C，菌液稀释倍数为D，则1毫升菌液中菌的总数为：C / 5×16×10×1000×D = 3200×C×D （个）实例：设五个中方格中的总菌数A为200个，菌液稀释倍数B为10倍，换算成1毫升醪液中的酵母细胞数。以一大方格的25个中方格计算如下：1毫升醪液中的总菌数 = 50000×A×B = 50000×200×10 = 1 亿个 / 毫升3. 酵母出芽率的测定计算酵母出芽率时，可续用数酵母细胞数制好的样片计算出芽酵母，出芽酵母大于母体一半者按两个酵母计，小于母体一半者，算出芽酵母一个。计数时边线上的酵母只计右线与下线，不计左线与上线。酵母出芽率计算公式为：4. 酵母细胞染色率的测定在生产过程中，生命力强的酵母菌具有旺盛的新陈代谢能力，当无毒染料对细胞进行染色时，即被细胞还原脱色。但衰老和死亡的细胞代谢能力弱或停止，被染色时无还原能力，所以易被染色。通常把被染色的细胞的百分率叫染色率，表示死亡细胞数量。其测定方法如下：滴一滴0.5%次甲基蓝溶液液于截玻片中央，滴加已稀释10倍的酵母液一滴与次甲基蓝液混合均匀，加盖一盖玻片，在显微镜下观察，计数方法与出芽率相同。并记下34个视野中总细胞数和被染色的细胞数，反复三次以求其平均值，按下式计算：5. 细菌感染率的测定酒母醪和发酵醪常常易为各种细菌所污染，细菌个体太细小，且减光率小，在显微镜下不易观察出来，若将它染色，减光率加大，就较易观察，故一般以一定体积的检液，用石碳酸复红染色法所检出的细胞数，与酵母细胞总数加细菌数之比值表示醪液的细胞感染百分数。（1） 试剂配制 香柏油 石碳酸复红液吸取5%的碱性复红液10ml及3%的石碳液90ml两者充分混合后，过滤即成。5%碱性复红液：称取碱性复红5克，用乙醇溶解并定容至100ml。3%石碳酸液：称取石碳酸3克，用水溶解定容至100ml。（2） 操作步骤检片的制备：取经水和酒精洗干净的载玻片一块，在酒精灯上烧去残酒，然后用胶头吸管取检液一滴平布于载片中央，涂片菌膜面向上在火焰上通过23次，使涂片上之菌体贴牢于载片上，以免染色洗涤时脱落。检液菌体被固定后，加石碳酸复红液数滴于涂片上稍摇动，使整个涂片面上都盖上染色液，于火焰上稍加垫，静置一分钟，然后用水小心冲洗，并用吸水纸吸干，稍停片刻待水汽全去掉后即可进行镜检。检查方法：加香柏油一滴于涂片上，将载片置显微镜下用油镜头观察，先数酵母总数，再数同一视野内被复红染色之球菌，杆菌等细胞数，共数五个视野，最后分别将各次所数得杂菌和酵母数相加后除以细菌总数求出杂菌感染率。计算公式如下：6. 发酵液酒份含量的测定用干净的100ml量筒，量取100ml发酵液倒入500ml三角瓶（或平底烧瓶中），并用清水100ml分数次清洗量筒，其洗液均加入三角瓶中，摇匀，置电炉上安装冷凝管进行加热蒸馏，接取蒸馏液100ml，停止蒸馏。将蒸馏液充分摇匀，用精密酒精计及温度计测定其酒份和温度，查酒精温度更正表确定发酵液的准确酒精浓度。7. 蒸馏废液含酒份的测定（1） 原理采用重铬酸钾比色法，先将废液的酒份蒸馏出来，再用重铬酸钾氧化，使六价铬还原为三价铬而产生绿色之后与标准颜色比较，求得废液的残酒份，此法测定残酒含量可达0.02%。其反应方程式如下：3 CH3CH2OH + 2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4 à 3 CH3COOH + 2 Cr2(SO4)3 + 2 K2SO4 + 11 H2O（2） 试剂配制 0.1%（V / V）乙醇标准溶液吸取无水乙醇0.1ml，加入100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，得0.1%（V / V）乙醇溶液。 2%重铬酸钾溶液称取重铬酸钾2克，用水溶解并稀释至100ml。 比重1.84的浓硫酸（3） 测定方法 标准管的制备在10ml比色管中，按下表加入各溶液编号（S）0123450.1%（V/V）标准乙醇（ml）012345水（ml）543210各管中注入2%重铬酸钾溶液1ml，摇匀，沿管壁注入比重1.84的浓硫酸5ml，摇匀。 试样管的制备量取蒸馏废液100ml，注入500ml三角瓶中，加200ml水，蒸馏，馏出液用100ml容量瓶准确收集100ml，摇匀。吸取5ml馏出液，注入10ml比色管中，加入2%重铬酸钾溶液1ml，浓硫酸5ml，摇匀，与标准管一起沸水浴中加热10分钟，取出冷却后，与标准管比色。 计算废液含酒份式中：S标准管的编号0.001标准书本溶液的浓度（毫升/ 100毫升）5吸取馏出液作分析用的毫升数例如：试样管的颜色与编号4的标准管相同，则废液酒精含量毫升/ 100毫升= 4 X 0.001 X 100 / 5 = 0.08(五) 实验数据分析与整理表1 发酵流加稀糖分析记录锤度（BX）pH酸度（°D）还原糖（%）蔗糖（%）总糖（%）备注表2 酒精连续发酵分析数据记录罐号发酵时间(h)品温()pH酸度()酵母数(亿/ml)出芽率(%)染色率(%)染菌率(%)还原糖(%)总糖(%)酒份(%)蒸馏废液含酒份(%)备注1234568(六) 根据实验数据书写实验报告实验报告包括实验的目的和意义，实验装置流程图，数据整理记录表，实验结论及问题讨论等内容。实验结论及问题讨论包括以下内容：1. 发酵率计算上式中0.6479是一公斤单糖理论上产无水酒精的量（以20时为标准）。2. 发酵周期计算式中：总容积指发酵成熟醪含酒份最高的罐之前的醪液总容积（每个罐V = 4升）流速指发酵醪在罐中的流速（约1.0升/小时）3. 计算发酵速度常数式中：S0表示发酵稀糖液的还原糖浓度S表示发酵t时间后发酵中还原糖浓度4. 发酵液稀释度计算式中：D发酵液稀释度f发酵液流速（米3/小时）V发酵成熟醪的体积5. 问题讨论根据发酵实验情况，分析影响酒精连续发酵的主要因素有哪些，如何提高发酵率，写出自己的认识和看法。(七) 实验注意事项1. 本实验是一综合性的工艺实验，检测项目多，每个小组之间要互相配合才能顺利完成。2. 实验检测数据必须认真做好记录，每个小组要负责把本小组的实验数据收集齐，做到检测结果准确可信。3. 每个组在开始实验前，必须认真阅读和熟悉所用的分析检测方法后才开始做实验。4. 实验时注意保护玻璃仪器，不得损坏，用电炉时要注意用电安全，不得违反实验操作规程。实验二 离子交换法提取谷氨酸实验一、 实验目的1. 熟悉离子交换装置的结构和使用方法。2. 熟悉离子交换法提取谷氨酸的工艺流程。3. 应用离子交换的理论和知识，通过实验，了解影响谷氨酸提取率的几个主要因素。二、 实验原理谷氨酸是两性电解质，是一种酸性氨基酸，等电点为pH 3.22，当pH > 3.22时，羧基离解而带负电荷，能被阴离子交换树脂交换吸附；当pH < 3.22时，氨基离解带正电荷，能被阳离子交换树脂交换吸附。也就是说，谷氨酸可被阴离子交换树脂吸附也可以被阳离子交换树脂吸附。由于谷氨酸是酸性氨基酸，被阴离子交换树脂的吸附能力强而被阳离子交换树脂的吸附能力弱，因此可选用弱碱性阴离子交换树脂或强酸性阳离子交换树脂来吸附谷氨酸。但是由于弱碱性阴离子交换树脂的机械强度和稳定性都比强酸性阳离子交换树脂差，价格又较贵，因此就都强酸性阳离子交换树脂而不选用弱碱性阴离子交换树脂。目前各种味精厂均采用732#强酸性阳离子交换树脂，本实验就是采用732#树脂。谷氨酸溶液中既含有谷氨酸也含有其他蛋白质、残糖、色素等妨碍谷氨酸结晶的存在。通过控制合适的交换条件，再根据树脂对谷氨酸以及对杂质吸附能力的差异，选择合适的洗脱剂和控制合适的洗脱条件，使谷氨酸和其他杂质分离，以达到浓缩提纯谷氨酸的目的。三、 实验装置1. 离子交换装置本实验采用动态法固定床的单床式离子交换装置。离子交换柱是有机玻璃柱，直径为90mm，长为700mm，柱底用玻璃珠及玻璃碎片装置，以防树脂漏出。2. 树脂本实验用苯乙烯强酸性阳离子交换树脂，编号为732#，其性能如下表：732#树脂的主要性能常数交联度粒度（目）最高耐热（）理论交换容量（mm01/g干树脂）湿视密度（g/cm3）pH范围溶胀率（%）水分（%）786093450.750.850142.25（水）4652四、 试剂配制1. 上柱交换液谷氨酸发酵液等电点母液，含谷氨酸2%左右。配制方法：取工厂购回的谷氨酸干粉180g溶于约1.5L自来水中，再加进约100ml浓盐酸使谷氨酸粉全部溶解，此时pH值约为1.5，最后稀释至9L。2. 洗脱用碱4%NaOH溶液。其配制方法有两种： 40g NaOH溶于1L自来水中。 工业用碱配制成4%浓度（W/W）,（约6°Be,相对密度1.04）。3. 再生用酸6%（W/W）盐酸溶液。把大约320ml浓盐酸（36%含量）用自来水稀释至2L。配成约4°Be，相对密度1.028的溶液。4. 0.5%茚三酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml丙酮溶液中配制成。五、 离交工艺流程上柱交换液 à 上柱交换 à 水洗杂质及疏松树脂 à 热水预热树脂 à 热碱洗脱 收集 低流分 高流分 尾流分 （PH 1.5 2.0） （PH 2.5 3.0） （PH 9 11） 直接等电点提取谷氨酸 在本实验中，低流分和尾流分都弃去不要。六、 实验步骤1. 检查离交柱工作状况。检查阀门，管理是否安装妥当，若有渗漏，及时报告。2. 计算上柱量先测量浸水后湿树脂的体积及上柱液总氨当量（其方法见后面附录），再按下式计算上柱量。根据实践，湿树脂实验交换当量为1.21.3mg当量/ml湿树脂。3. 上柱交换本实验用顺上柱方式。先把树脂上的水从底阀排走，排至清水高出树脂而5cm左右，同时调节柱底流出液速度，控制其流速为150ml/min左右。然后把上柱液放入高位槽中，开启阀门，进行交换吸附。注意使柱的上，下流速平衡，即不“干柱”也要避免上柱液溢出离交柱。前期流速为150ml/min左右，后期流速为130ml/min左右。每流出500ml流出液，用PH试纸及波美比重计测量其PH值及浓度，记录下来。间断用茚三酮溶液检查是否有