多聚酶链式反应扩增DNA片段（用）.ppt
温故知新温故知新1:1:组成组成DNADNA分子的分子的基本单位基本单位是什么是什么? ?这些基本单位是如何连接成这些基本单位是如何连接成DNADNA分子的分子的? ?DNADNA分子结构有什么特点？分子结构有什么特点？脱脱氧氧核核苷苷酸酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧脱氧核糖核糖含氮含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺腺嘌呤（嘌呤（A A）鸟鸟嘌呤（嘌呤（GG）胞胞嘧啶（嘧啶（C C）胸腺胸腺嘧啶（嘧啶（T T）1 12 23 34 45 5OOPOHO碱基碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖53脱氧核苷酸链结构简图脱氧核苷酸链结构简图磷酸二酯键磷酸二酯键5533细胞中细胞中DNADNA分子的复制过程是怎样的？分子的复制过程是怎样的？细胞中细胞中DNADNA分子的复制需要哪些条件？分子的复制需要哪些条件？温故知新温故知新2 2DNADNA母链：母链：提供复制的模板提供复制的模板解旋酶：解旋酶：打开打开DNADNA双链双链4 4种脱氧核苷酸：种脱氧核苷酸：合成子链的原料合成子链的原料DNADNA聚合酶：聚合酶：催化合成催化合成DNADNA子链子链ATPATP：为复制过程提供能量为复制过程提供能量引物：引物：使使DNADNA聚合酶从引物的聚合酶从引物的3 3端开始端开始连接脱氧核苷酸连接脱氧核苷酸( (一小段一小段RNA)RNA)细胞内细胞内DNADNA复制的条件复制的条件1、 PCRPCR（多聚酶链式反应）技术：（多聚酶链式反应）技术：是一种是一种体体外外迅速扩增迅速扩增DNADNA片段的技术，它能以极少量的片段的技术，它能以极少量的DNADNA为模板，在几小时内复制出上百万份的为模板，在几小时内复制出上百万份的DNADNA拷贝。拷贝。2 2、原理：、原理：利用了利用了DNADNA的热变性的热变性原理，通过控制原理，通过控制温温度度来控制双链的解聚与结合。来控制双链的解聚与结合。一、基础知识一、基础知识（一）（一）PCRPCR原理：原理：DNADNA母链：母链：提供复制的模板提供复制的模板解旋酶：解旋酶： 打开打开DNADNA双链双链4 4种脱氧核苷酸：种脱氧核苷酸：合成子链的原料合成子链的原料DNADNA聚合酶：聚合酶： 催化合成催化合成DNADNA子链子链ATPATP：为复制过程提供能量为复制过程提供能量引物：引物：使使DNADNA聚合酶从引物的聚合酶从引物的3 3端开始连端开始连 接脱氧核苷酸接脱氧核苷酸( (一小段一小段RNARNA) )3 3、PCRPCR反应的条件反应的条件8080100100：耐热的耐热的DNADNA聚合酶：聚合酶：缓冲溶液：缓冲溶液：维持反应的维持反应的pHpH值不变值不变( (一般是一小段单链一般是一小段单链DNA)DNA)细胞中细胞中DNADNA复制条件复制条件 温度上升到温度上升到9090以上以上时时, ,双链双链DNADNA解解聚聚成为单链。成为单链。 温度下降到温度下降到5050左右左右, ,引物与引物与模板模板DNADNA单链单链的互补序列配对的互补序列配对结合结合。 温度上升到温度上升到7272左右左右, ,溶液中的溶液中的4 4种种脱氧核苷酸在脱氧核苷酸在TaqTaq DNADNA聚合酶聚合酶的作用下的作用下, ,根根据碱基互补配对的原则据碱基互补配对的原则合成新的合成新的DNADNA链链。PCRPCR 循环第一步循环第一步 ：加热变性加热变性(80-100(80-100) )双链双链DNADNA解聚成为单链解聚成为单链PCRPCR 循环第二步循环第二步 ：引物与：引物与模板模板序列序列复性（退火）复性（退火）: :引物与模板引物与模板DNADNA单链单链的互补序列配对结合的互补序列配对结合模板序列模板序列模板序列模板序列引物引物引物引物553 3555533553333TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶PCRPCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸引物延伸(72 (72 左右左右) )合成新的合成新的DNADNA链链第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 ：得到：得到两个两个拷贝的靶序列拷贝的靶序列循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,8243030次循环后扩增的数量次循环后扩增的数量4 4、PCR PCR 循环的结果循环的结果 DNADNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的物之间的DNADNA序列序列，使这段固定长度的序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增呈指数扩增。从第二轮循环开始，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作上一次循环的产物也作为模板参与反应为模板参与反应，并且由，并且由引物引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与引物单链会与引物结合结合，进行，进行DNADNA的延伸。的延伸。第一轮结果第一轮结果12341234第二轮结果第二轮结果二、二、 实验操作实验操作1 1、PCRPCR仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器。的仪器。2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml。3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液体，液体，其上的其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。一次性吸液枪头用一次更换一次。1 1、准备、准备2 2、移液、移液（二）实验操作步骤（二）实验操作步骤按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的试剂反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上摆放在实验桌上用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方往微量反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂离心管里面加入各种试剂过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。轻弹击管壁。注意：注意：3 3、混合、混合B B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是目的是使反应液混合均匀。使反应液混合均匀。A A、离心管口的盖子一定盖严，离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱防止实验中脱落或液体外溢。落或液体外溢。将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循仪的循环程序。环程序。过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上, ,离心约离心约10s10s。4 4、离心、离心5 5、反应、反应离心目的：使反应液体集中在离心管底部，离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。提高反应效果。循环数循环数变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性9494，5min5min3030次次9494，30s30s5555，30s30s7272，1min1min最后一次最后一次 9494，1min1min5555，30s30s7272，1min1minPCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免为了避免外源外源DNADNA等因素等因素的污的污染而造成干扰实验，染而造成干扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意做到：6 6、注意事项、注意事项隔离操作区隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，使用分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头一次性枪头, ,一一次性吸液枪头次性吸液枪头用一次更换一次用一次更换一次。 （一）理论上（一）理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算三、三、课题成果评价课题成果评价1 1 、一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次， DNADNA为：为：2 2n n2 2 、 a a条条DNADNA，复制，复制n n次，次， DNADNA为：为：a2a2n n（二）实验中（二）实验中DNADNA含量的测定含量的测定1 1 、原理原理可以通过计算可以通过计算DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与峰值的大小与DNADNA的的含量有关含量有关。2 2 、过程过程稀释稀释2uL2uLPCRPCR反应液，加入反应液，加入98uL98uL蒸馏水，即将样蒸馏水，即将样品进行品进行5050倍稀释倍稀释。对照调零对照调零以蒸馏水作为以蒸馏水作为空白对照空白对照，在波长，在波长260nm260nm处，将处，将紫外分光光度计的紫外分光光度计的读数调节至零读数调节至零。取取DNADNA稀释液稀释液100uL100uL至至比色杯中，测定比色杯中，测定260nm260nm处的处的光吸收值光吸收值。计算计算计算计算DNADNA含量（含量（ g g ）5050* * x x（260nm260nm的读数）的读数）x x稀释稀释倍数倍数公式中公式中5050的含义的含义：5050 g g /ml /ml的的DNADNA在标准厚度在标准厚度为为1cm1cm比色杯中的吸光值为比色杯中的吸光值为1 1。比色杯比色杯
