动物细胞培养.ppt

植物组织培养就是在无菌和人工控制条植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。成完整的植株。植物组织培养的概念植物组织培养的概念植物组织培养的过程植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织愈伤组织脱分化脱分化植物激素：植物激素： 细胞分裂素、细胞分裂素、生长素生长素植物体植物体根、芽根、芽再分化再分化外植体外植体 让已经分化的细胞，经过诱导让已经分化的细胞，经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的过程变成未分化细胞的过程. 愈伤组织是指一些已经分化愈伤组织是指一些已经分化的细胞，经过激素的诱导，形成的细胞，经过激素的诱导，形成的具有分生能力的薄壁细胞团。的具有分生能力的薄壁细胞团。将不同种的植物体细胞，在一定将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。胞培育成新的植物体的技术。植物体细胞杂交的概念植物体细胞杂交的概念杂杂种种植植株株再再 分分 化化植物细胞的融合植物细胞的融合植物组织培养植物组织培养原生质体原生质体B原生质体原生质体A再生再生出细出细胞壁胞壁杂种杂种细胞细胞AB脱脱 分分 化化愈愈伤伤组组织织去壁去壁去壁去壁融合的融合的原生质原生质体体AB人人 工工 诱诱 导导植物细胞植物细胞A植物细胞植物细胞B植物体细胞杂交的过程植物体细胞杂交的过程专题二细胞工程专题二细胞工程制备单克隆抗体制备单克隆抗体 动物细胞培养动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞核移植动物细胞融合动物细胞融合动物细胞工程常用的技术动物细胞工程常用的技术是其他动物细胞工程技术的基础。是其他动物细胞工程技术的基础。 1.1.动物细胞培养动物细胞培养 从动物机体中取出相关组织，将它们分散从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。些细胞生长和增殖。1.11.1动物细胞培养的概念动物细胞培养的概念2.2.1动物细胞培养和核移植技术动物细胞培养和核移植技术1.2 1.2 动物细胞培养过程动物细胞培养过程 胚胎或幼龄动物的组织器官胚胎或幼龄动物的组织器官细胞悬液剪碎剪碎胰蛋白酶胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）（或胶原蛋白酶）动物细胞培养适宜的动物细胞培养适宜的PHPH为为7.27.27.47.4，此环境下胃蛋白酶（此环境下胃蛋白酶（1.91.9）没有活性，而胰）没有活性，而胰蛋白酶蛋白酶(7.2-8.4)(7.2-8.4)的活性较高。的活性较高。动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。定弹性和韧性的组织和器官。 比老龄动物的组织细胞增殖能力比老龄动物的组织细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛。分化程度越低，强，有丝分裂旺盛。分化程度越低，繁殖能力越强，越容易培养。繁殖能力越强，越容易培养。1.2 1.2 动物细胞培养过程动物细胞培养过程 胚胎或幼龄动物的组织器官胚胎或幼龄动物的组织器官细胞悬液细胞悬液剪碎剪碎胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）原代培养原代培养贴壁生长接触抑制贴壁生长接触抑制细胞贴壁细胞贴壁 细胞贴壁过程细胞贴壁过程有关概念有关概念: :原代培养：原代培养：从机体取出后立即培养的细胞从机体取出后立即培养的细胞 为原代细胞；将动物组织消化后的初为原代细胞；将动物组织消化后的初 次培养称为原代培养。次培养称为原代培养。 原代培养的细胞保持原有细胞原代培养的细胞保持原有细胞 的基本性质，如果是正常细胞，仍然的基本性质，如果是正常细胞，仍然 保留二倍体数。保留二倍体数。细胞增殖缓慢，细胞增殖缓慢，核型可能变化核型可能变化1.2 1.2 动物细胞培养过程动物细胞培养过程 胚胎或幼龄动物的组织器官胚胎或幼龄动物的组织器官细胞悬液细胞悬液剪碎剪碎胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）贴壁生长接触抑制贴壁生长接触抑制贴壁细胞贴壁细胞 细胞株细胞株传代培养（传代培养（50代左右）代左右）洗涤、稀释、分离洗涤、稀释、分离传代细胞传代细胞 原代培养原代培养细胞系细胞系50代以后代以后不死细胞不死细胞动物细胞培养不能动物细胞培养不能最终培养成生物体最终培养成生物体 将贴满瓶壁的细胞从培养瓶中取出，重新用将贴满瓶壁的细胞从培养瓶中取出，重新用胰蛋白酶等处理，配制成细胞悬浮液，分装到胰蛋白酶等处理，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。代培养。 传代培养的细胞一般传至传代培养的细胞一般传至1010代就不易传下去，代就不易传下去，只有极少数的细胞会继续传至只有极少数的细胞会继续传至5050代左右，即便代左右，即便如此，传至如此，传至5050代以后的细胞绝大多数死亡，只代以后的细胞绝大多数死亡，只有极少数细胞的克服细胞寿命的极限，成为不有极少数细胞的克服细胞寿命的极限，成为不死的细胞。死的细胞。有关概念有关概念_传代培养：传代培养：原代培养和传代培养原代培养和传代培养 50代代细胞细胞无限无限传代传代10代代细胞细胞原代原代培养培养细胞悬细胞悬浮液浮液多数组织细胞固定在表面生长和分裂多数组织细胞固定在表面生长和分裂随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖传代传代培养培养1.3 动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件1.1.无菌、无毒的环境无菌、无毒的环境（无菌处理、加一定的抗生素，防止污染、定期更（无菌处理、加一定的抗生素，防止污染、定期更 换培养液）换培养液） 2.2.必需的营养物质必需的营养物质 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、激素、促生（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、激素、促生 长因子、动物血清等）长因子、动物血清等）3. 3. 适宜的温度适宜的温度: : 36.536.50.50.5度度4. 4. 充足的氧气和适宜的酸碱度充足的氧气和适宜的酸碱度: : O O2 2和和COCO2 2（95%95%氧气和氧气和5% CO5% CO2 2 ）；）；PHPH为为7.2_7.47.2_7.4 为什么对动物细胞进行培养时通常要添加为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？血清？血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。有血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。有些氨基酸（必需氨基酸）动物细胞本身不能合成必须由些氨基酸（必需氨基酸）动物细胞本身不能合成必须由培养液提供。培养液提供。 血清中有胰岛素、生长激素等及多种生长因子。血血清中有胰岛素、生长激素等及多种生长因子。血清中还含有多种未知的活性物质，能促进细胞的生长、清中还含有多种未知的活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。增殖和贴附。 因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般须添加殖，一般须添加10%10%20%20%的血清。的血清。 思考：思考：植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质培养基特有成分培养基特有成分培养结果培养结果培养目的培养目的植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基培养基特有成分培养基特有成分培养结果培养结果培养目的培养目的植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基培养基特有成分培养基特有成分蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清培养结果培养结果培养目的培养目的植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基培养基特有成分培养基特有成分蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清培养结果培养结果完整的植物体完整的植物体细胞群体细胞群体培养目的培养目的植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基培养基特有成分培养基特有成分蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清培养结果培养结果完整的植物体完整的植物体细胞群体细胞群体培养目的培养目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等获得细胞或细胞分获得细胞或细胞分泌蛋白等泌蛋白等1、成份不同、成份不同2、物质性质不同、物质性质不同A思考动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于（动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于（ ） A.A.培养基不同；培养基不同； B.B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；动物细胞培养不需要在无菌条件下进行； C.C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能； D.D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培 养成植株。养成植株。1.4 动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用1 1、大规模生产有重要价值的生物制品；、大规模生产有重要价值的生物制品；2 2、检测有毒物质，判断某种物质的毒性；、检测有毒物质，判断某种物质的毒性；3 3、作为基因工程受体细胞培养；、作为基因工程受体细胞培养；4 4、为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据；、为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据；2.动物细胞核移植技术和克隆动物动物细胞核移植技术和克隆动物将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动动物个体（克隆动物）。物）。 2.1 2.1 动物细胞核移植概念：动物细胞核移植概念：分分 类类胚胎细胞核移植：胚胎细胞核移植：体细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能细胞分化程度低，恢复全能性容易性容易细胞分化程度高，恢复全细胞分化程度高，恢复全能性不容易能性不容易2.22.2体细胞核移植的过程：体细胞核移植的过程：请看教材请看教材P48P48图图2-212-21思考：思考： 1.1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？ 2.2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？ MM中期卵母细胞中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。细胞分裂和发育进程。体积较大，易于操作体积较大，易于操作讨讨 论论1.1.在体细胞的细胞核移植到受体卵在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？母细胞的核？ 为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。遗传物质去掉或将其破坏。培养的动物细胞一般当传代至培养的动物细胞一般当传代至10105050代左右时，代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而会发生突变，而1010代以内的细胞一般能保持正常的二代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代细胞正常的遗传基础，通常采用传代1010代以内的细胞。代以内的细胞。2.2.用于核移植的供体细胞一般都选用于核移植的供体细胞一般都选用传代用传代1010代以内的细胞，想一想，这是代以内的细胞，想一想，这是为什么？为什么？多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程卵细胞卵细胞A母绵羊母绵羊B母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠融合后的卵细胞融合后的卵细胞3.3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了动物，是对体细胞供体动物进行了100%100%的复制吗？的复制吗？为什么？为什么？绝大部分绝大部分DNADNA来自于供体细胞核，但其核外还有来自于供体细胞核，但其核外还有少量的少量的DNADNA，即线粒体中的，即线粒体中的DNADNA是来自于受体卵母细是来自于受体卵母细胞。胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%100%的复制。的复制。2.32.3体细胞核移植技术的应用前景：体细胞核移植技术的应用前景：1.1.在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程进程2.2.保护濒危物种保护濒危物种3.3.医药卫生领域生产医用蛋白质及组织医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植器官的移植2.32.3体细胞核移植技术的应用前景：体细胞核移植技术的应用前景：1.1.在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程进程2.2.保护濒危物种保护濒危物种3.3.医药卫生领域生产医用蛋白质及组织医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植器官的移植4.4.了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病疾病的发展过程和治疗疾病 2.42.4体细胞核移植技术存在的问题：体细胞核移植技术存在的问题：1 1、成功率低、成功率低2 2、克隆动物存在健康问题、克隆动物存在健康问题 许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。免疫失调等。3 3、克隆食品的安全性也存在着争议、克隆食品的安全性也存在着争议思考与探究思考与探究2.2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？为什么？动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。需要的组织或器官。3.19973.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（场有一头名叫卢辛达（LucindaLucinda）的奶牛，年）的奶牛，年产奶量为产奶量为30.8 t30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为奶量年平均水平仅为3 34t4t。（1 1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。卢辛达吗？请说明理由。 可以。卢辛达有高产奶的遗传基础，利用卢辛可以。卢辛达有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛也具有高产该奶牛，其克隆牛也具有高产奶奶的遗传基因。的遗传基因。（2 2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？给你，你将如何对它进行克隆？从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。取牛卵巢，抽取卵母该组织（如软骨组织）的细胞。取牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微操作去除卵母细胞的核，细胞体外培养成熟。用显微操作去除卵母细胞的核，再将耳细胞再将耳细胞核核注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，胞与体细胞融合，再用电刺激或化学物质激活注入了再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。4.自然界中有一种含有叶绿体的原生动物自然界中有一种含有叶绿体的原生动物眼虫，说明植物的细胞器同样可以在某些眼虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活，请探讨：动物细胞与植物细动物细胞中存活，请探讨：动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗？如果理论上可行，请胞之间可以实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出具体实验方案。设计出具体实验方案。