最新复件微生物检测第5章1ppt课件.ppt

主要的食物导致的疾病疾病致病菌潜伏期和特征相关食品沙门氏菌病鼠伤寒沙门菌（S.typhimurium）猪霍乱沙门菌（S.enteritidis）8-48h;肠毒素和细胞毒素肉类，家禽，鱼，蛋，乳制品弓形菌腹泻布氏弓形菌（Arcobacter butzleri）严重腹泻，反复抽筋肉制品,尤其是家禽弯曲杆菌病空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）2-10d, 毒素热不稳定牛奶，猪肉，家禽，水李斯特菌病单核细胞增生李斯特菌与脑膜炎和畸型有关肉制品，尤其是猪肉和牛奶大肠杆菌腹泻和结肠炎大肠杆菌24-72 h夹生的碎牛肉，生牛奶痢疾宋内志贺氏菌（Shigella sonnei）福氏志贺氏菌（S. flexneri）24-72 h蛋类，布丁耶尔森菌病小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)16-48 h,一些热稳定的毒素牛奶，肉制品贺邻单胞菌病类志贺邻单胞菌（Plesiononas shigelloides）1-2 h生的软体动物和外国旅行食品副溶血弧菌胃肠炎副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)16-48 h海鲜，贝壳类4.4.抗原结构抗原结构n菌体抗原（菌体抗原（O O抗原）：是细胞壁成分。耐热、抗原）：是细胞壁成分。耐热、121 121 不破坏，有不破坏，有171171种血清型。种血清型。n表面抗原（表面抗原（K K抗原）：是存在于荚膜、被膜体表部抗原）：是存在于荚膜、被膜体表部分的抗原。不能被分的抗原。不能被O O血清所凝集，具有血清所凝集，具有O O不凝集性。不凝集性。n鞭毛抗原（鞭毛抗原（H H抗原）：由不耐热的蛋白质组成，抗原）：由不耐热的蛋白质组成，60 60 被破坏。共有被破坏。共有5656个血清型。个血清型。n抗原式为：抗原式为：O O111111K K5858H H12125.5.抵抗力抵抗力n对热的抵抗力较强对热的抵抗力较强n在自然界中可存活数周在自然界中可存活数周至数月至数月n对磺胺类、四环类等抗对磺胺类、四环类等抗生素敏感生素敏感n对煌绿染料比沙门氏菌对煌绿染料比沙门氏菌敏感敏感n耐胆盐耐胆盐n对漂白粉、酚、醛等敏对漂白粉、酚、醛等敏感感6 6. .致病力致病力n侵袭力侵袭力: :K K抗原、菌毛抗原、菌毛n内毒素：类脂内毒素：类脂A An肠毒素：肠毒素：肠产毒型大肠产毒型大肠杆菌类似于霍乱弧肠杆菌类似于霍乱弧菌。产生两类肠毒素。菌。产生两类肠毒素。均在质粒中编码。均在质粒中编码。毒素类型毒素类型热不稳定性肠毒素（热不稳定性肠毒素（heat-labile toxin, LT）热稳定性肠毒素（热稳定性肠毒素（heat-stable toxin, ST）分子量分子量7 30007 30001500-50001500-5000耐热性耐热性65 30min65 30min破坏破坏100 10-20min100 10-20min不破坏不破坏免疫原性免疫原性有有无无B亚单位受体亚单位受体肠粘膜肠粘膜GM1GM1神经节苷酯神经节苷酯肠粘膜肠粘膜GM1GM1神经节苷酯神经节苷酯致病机理致病机理刺激小肠上皮细胞的腺苷环化刺激小肠上皮细胞的腺苷环化酶，使酶，使ATPATP转化成转化成cAMPcAMP，促进促进肠粘膜细胞分泌，肠液大量分肠粘膜细胞分泌，肠液大量分泌引起腹泻泌引起腹泻刺激小肠上皮细胞的鸟苷刺激小肠上皮细胞的鸟苷环化酶，使环化酶，使cGMPcGMP水平升高，水平升高，促进肠粘膜细胞分泌亢进，促进肠粘膜细胞分泌亢进，引起腹泻引起腹泻兔毛细血管通透性兔毛细血管通透性增加增加无改变无改变乳鼠灌胃试验乳鼠灌胃试验不敏感不敏感敏感敏感编码基因编码基因质粒质粒质粒质粒致病性大肠埃希菌主要分为五类：致病性大肠埃希菌主要分为五类：n肠产毒型肠产毒型（enterotoxigenic E.coli ,ETEC）n肠致病型肠致病型 (enteropathogenic E.coli ,EPEC)n肠侵袭型肠侵袭型 (enteroivasive E.coli ,EIEC)n肠出血型肠出血型 (enterohemorrhagic E.coli ,EHEC)：又称Vero毒素大肠埃希菌（Verotoxigenic E.coli ,VTEC ），O157：Hn肠粘附型肠粘附型(enteroadherent, E.coli ,EAEC)：肠聚集型菌型血清型吸附和入侵特征毒素病征肠产毒型ETECO6,O8,O15,O20,O27,O63,O78,O80,O85,O115,O128,O139,O148,O153,O159,O167始终吸附小肠上皮细胞但不入侵LTST类霍乱腹泻，但不严重肠致病型EPECO18,O44,O55,O86,O111,O112,O114,O119,O125,O126, O127,O128,O142丛状吸附小肠上皮细胞，入侵，破坏细胞不明显婴儿腹泻，呕吐肠侵袭型EIECO124,O143,O152进攻结肠细胞，向邻近细胞扩散细胞-细胞间传播，类似于痢疾肠出血型EHECO6, O26, O46, O48, O91,O98,O111,O112,O146,O157,O165吸附、 结合、破坏、进攻结肠类似于志贺氏菌的细胞毒素带血腹泻，出血性结肠炎，进而发生溶血性尿毒综合征（HUS），并形成血栓，血小板减少性紫癜肠粘附型EAEC血清型很广，血清型很广，O62,O73,O134丛状吸附小肠上皮细胞，不进攻细胞一些菌株有类ST毒素、溶血素、细胞毒素腹泻，一些菌株会引发溶血性尿毒综合征引起腹泻的大肠埃希菌种类及主要特征引起腹泻的大肠埃希菌种类及主要特征大肠杆菌大肠杆菌O157O157n19821982年在美国的一次汉堡包食物中毒事件中首次被发年在美国的一次汉堡包食物中毒事件中首次被发现。现。 96年在日本流行。年在日本流行。n寄生在牛、羊等动物的肠道内以及土壤和污水中，中寄生在牛、羊等动物的肠道内以及土壤和污水中，中毒者往往都伴有剧烈的腹痛、高烧和血痢，病情严重毒者往往都伴有剧烈的腹痛、高烧和血痢，病情严重者会危及生命。者会危及生命。n美国威斯康星大学绘制出其完整基因组图谱。发现了美国威斯康星大学绘制出其完整基因组图谱。发现了13871387个特有的新基因。个特有的新基因。n具有一些被称为具有一些被称为“DNADNA岛岛”的特殊片断，像岛屿一样的特殊片断，像岛屿一样分散在整个基因组中。其中一些分散在整个基因组中。其中一些“DNADNA岛岛”里包含有里包含有与致病过程有关的基因，能够控制产生毒素，或帮助与致病过程有关的基因，能够控制产生毒素，或帮助O157O157更牢固地附着在肠胃中。更牢固地附着在肠胃中。大肠杆菌大肠杆菌O26O26n英英2 2年死年死8383人人, , 可导致血液感染及尿道感染，年纪可导致血液感染及尿道感染，年纪较大或患有其他严重疾病的感染人士很可能出现其较大或患有其他严重疾病的感染人士很可能出现其他并发症。他并发症。n导致血液感染的大肠杆菌个案，在过去导致血液感染的大肠杆菌个案，在过去1010年来已上年来已上升升1 1倍；倍；n抗药性的个案从抗药性的个案从20012001年的年的2%2%上升至上升至20042004年的年的6%6%。二、大肠埃希菌检查法二、大肠埃希菌检查法供试品供试品供试液供试液胆盐乳胆盐乳糖增菌糖增菌MacCEMB纯培养纯培养乳糖发酵乳糖发酵IMViC报告报告v革兰氏阴性无芽孢杆革兰氏阴性无芽孢杆菌菌v乳糖产酸产气或产酸乳糖产酸产气或产酸不产气不产气vIMViC试验为试验为+-或或-+-v判为检出大肠埃希菌判为检出大肠埃希菌IMViCn靛基质试验靛基质试验(indol test)： 取培养物接种于胨水培养基，培养取培养物接种于胨水培养基，培养24-48h，沿沿管壁加入柯凡克试剂数滴，液面呈玫瑰红色为阳管壁加入柯凡克试剂数滴，液面呈玫瑰红色为阳性性.原理：原理： 含有色氨酸酶的细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，含有色氨酸酶的细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，形成吲哚。吲哚无色，加入对二甲氨基苯甲醛后，形成吲哚。吲哚无色，加入对二甲氨基苯甲醛后，形成红紫色醌式化合物，即玫瑰吲哚。形成红紫色醌式化合物，即玫瑰吲哚。 n甲基红试验甲基红试验(methyl red test)：取培取培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基，培养基，培养48h，沿管壁加入甲基红沿管壁加入甲基红试剂试剂5-6滴，液面呈鲜红色或橘红色滴，液面呈鲜红色或橘红色为阳性。为阳性。原理：细菌发酵葡萄糖，在磷酸盐葡原理：细菌发酵葡萄糖，在磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，发酵产酸，使萄糖胨水培养基中，发酵产酸，使甲基红试剂变色而呈阳性反应。有甲基红试剂变色而呈阳性反应。有的细菌可使的细菌可使pH下降至于下降至于4.5或更低；或更低；有的则使发酵产物脱羧而产生中性有的则使发酵产物脱羧而产生中性乙酰甲基甲醇，使乙酰甲基甲醇，使pH回升至回升至5.4以以上。上。乙酰甲基甲醇生成试验乙酰甲基甲醇生成试验n(Voges-Prokauer test)：取培养物接种于磷酸盐取培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基，培养葡萄糖胨水培养基，培养48h，沿管壁加入沿管壁加入a萘萘酚乙醇试剂酚乙醇试剂1mL，混匀，再加混匀，再加40%氢氧化钾试氢氧化钾试液液0.4mL，摇匀，摇匀，4h内出现红色为阳性。内出现红色为阳性。原理：细菌发酵葡萄糖生成丙酮酸，再脱羧生成原理：细菌发酵葡萄糖生成丙酮酸，再脱羧生成乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇。在碱性溶液中氧化生成二乙酰。在碱性溶液中氧化生成二乙酰（丁二酮）。再与蛋白胨中精氨酸的胍基作用（丁二酮）。再与蛋白胨中精氨酸的胍基作用生成红色化合物。生成红色化合物。一般情况下，与甲基红反应一般情况下，与甲基红反应呈相反结果。呈相反结果。n柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐利用试验(citrate test)：取培养物接种于柠檬酸盐培养基，取培养物接种于柠檬酸盐培养基，培养培养2-4天天，斜面有菌苔生长，斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性。培养基由绿色变为蓝色时为阳性。原理：柠檬酸盐利用培养基是合成原理：柠檬酸盐利用培养基是合成培养基，不含蛋白胨和糖类，以培养基，不含蛋白胨和糖类，以柠檬酸钠为惟一碳源，磷酸二氢柠檬酸钠为惟一碳源，磷酸二氢铵为唯一铵盐，细菌在柠檬酸盐铵为唯一铵盐，细菌在柠檬酸盐利用培养基生长，柠檬酸钠被分利用培养基生长，柠檬酸钠被分解生成碳酸钠与水，使培养基解生成碳酸钠与水，使培养基pH升高，溴麝香草酚蓝指示剂升高，溴麝香草酚蓝指示剂显蓝色。显蓝色。硫化氢试验硫化氢试验n将细菌穿刺接种于三糖铁琼脂或克氏双将细菌穿刺接种于三糖铁琼脂或克氏双糖铁琼斜面、或硫酸亚铁琼脂中，糖铁琼斜面、或硫酸亚铁琼脂中，24-24-4848h h，培养基底层出现黑色即为阳性反应。培养基底层出现黑色即为阳性反应。原理：细菌对培养基中硫代硫酸钠或硫酸原理：细菌对培养基中硫代硫酸钠或硫酸钠、亚硫酸钠的有还原作用，生成硫化钠、亚硫酸钠的有还原作用，生成硫化氢。硫化氢遇硫酸亚铁或柠檬酸铁铵产氢。硫化氢遇硫酸亚铁或柠檬酸铁铵产生不溶性黑色硫化亚铁。生不溶性黑色硫化亚铁。血清学试验血清学试验n假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的琼脂培养物，用各类大肠埃希氏菌的多价的琼脂培养物，用各类大肠埃希氏菌的多价O O血清血清做玻片凝集试验。当与某一种多价做玻片凝集试验。当与某一种多价O O血清凝集时，血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价再与该多价血清所包含的单价O O血清做试验。如与血清做试验。如与某一单价某一单价O O血清呈强凝集反应，即为假定试验阳性。血清呈强凝集反应，即为假定试验阳性。n证实试验证实试验: :制备制备O O抗原悬液抗原悬液, ,稀释至与稀释至与MacFarland3MacFarland3号比浊管相当的浓度。将号比浊管相当的浓度。将O O血清用生理盐水稀释至血清用生理盐水稀释至1 1：4040。在试管内等量混合，做试管凝集试验。混。在试管内等量混合，做试管凝集试验。混匀后在匀后在5050水浴箱内水浴箱内1616h h后观察结果。出现凝集则后观察结果。出现凝集则可证实为可证实为O O抗原。抗原。氧化酶试验氧化酶试验待检菌新鲜培养物待检菌新鲜培养物挑菌落于滤纸挑菌落于滤纸3618-24h氧化型色素氧化型色素阳性细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶四甲基对苯二胺盐酸盐四甲基对苯二胺盐酸盐a-a-萘酚乙醇溶液萘酚乙醇溶液1-21-2滴滴还原型色素还原型色素吲哚酚蓝u避免同铁镍接触u避免用含葡萄糖培养基u菌落新鲜u试剂新鲜u有氧条件三、三、MUG-Indole检查法检查法1 1. .原理原理 97% 97%的大肠埃希菌和部分志贺菌、沙门氏菌中含的大肠埃希菌和部分志贺菌、沙门氏菌中含有有 - -葡萄糖醛酸苷酶（葡萄糖醛酸苷酶（ - -glucuronidase,GUD glucuronidase,GUD ）。）。利用目标菌的限定酶作用的底物利用目标菌的限定酶作用的底物4-4-甲基伞形酮甲基伞形酮- - - -D-D-葡萄糖酸苷（葡萄糖酸苷（4-4-Methylumbelliferyl- Methylumbelliferyl- - -D-D-Glucuronide, MUGGlucuronide, MUG）被被 - -葡萄糖醛酸苷酶分解，在葡萄糖醛酸苷酶分解，在366366nmnm紫外灯下产生蓝白色荧光作为指示系统来鉴定紫外灯下产生蓝白色荧光作为指示系统来鉴定目标菌。目标菌。 但漏检率为但漏检率为6%6%，因此采用与吲哚反应相结合，因此采用与吲哚反应相结合，辅以辅以IMViCIMViC试验，在理论上检出率可达试验，在理论上检出率可达99%99%。24-4824-48h h可报告结果。可报告结果。2 2. .检验程序检验程序供试品供试品供试液供试液BL增菌液增菌液MacCEMB疑似菌落疑似菌落纯培养纯培养乳糖发酵乳糖发酵IMViC报报告告MUG蛋白胨蛋白胨MUG+，I+MUG-，I-MUG+，I-MUG-，I+革兰染色革兰染色报报告告3 3. .注意事项注意事项n配制配制MUGMUG培养基时，务必校正培养基时，务必校正pHpH值，值，pHpH不不得过得过7.47.4，否则，否则MUGMUG管自身发荧光。管自身发荧光。n培养时间一般培养时间一般4 4h h，24h24h，可延长可延长4848h h。n结果观察时要将阳性对照管、阴性对照结果观察时要将阳性对照管、阴性对照管和供试品的管和供试品的MUGMUG管同时在管同时在366366nmnm紫外灯紫外灯下观察，如阳性管荧光强烈时，可移去，下观察，如阳性管荧光强烈时，可移去，以免影响另两管的观测。以免影响另两管的观测。四、肠毒素检验四、肠毒素检验n1 1. .产毒培养：将试验菌株和对照菌株分别接于产毒培养：将试验菌株和对照菌株分别接于0.60.6mLmL产毒素培养基内，产毒素培养基内，3737振荡培养过夜。振荡培养过夜。加入适量多粘菌素，加入适量多粘菌素，3737培养培养1 1h h，4000r/min4000r/min离心离心1515minmin，取上清，加入适量硫柳汞，取上清，加入适量硫柳汞，44保保存待用。存待用。n2 2.ELISA.ELISA（enzyme linked immunosorbent assayenzyme linked immunosorbent assay）检测检测LTLT和和STST间接法间接法双抗体夹心法检测双抗体夹心法检测LTLTn结果判定：以酶标仪在结果判定：以酶标仪在492nm下测定吸下测定吸光度光度OD值，待测样本值，待测样本OD值大于阴性对值大于阴性对照照3倍以上为阳性。或目测为橘黄色。倍以上为阳性。或目测为橘黄色。抗原竞争法检测抗原竞争法检测ST抗原竞争法测抗原竞争法测STSTn结果判定：结果判定：n以酶标仪在以酶标仪在492nm下测定吸光度下测定吸光度OD值。值。n 阴性对照阴性对照OD值值-待测样本待测样本OD值值n 阴性对照阴性对照OD值值 目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。100%50%3 3 反向乳胶凝集法反向乳胶凝集法 （resersed passive latex agglutination, RPLAresersed passive latex agglutination, RPLA）包被了抗体的乳胶粒子包被了抗体的乳胶粒子毒素（抗原）毒素（抗原）检样检样大肠菌群大肠菌群MPN25g+营养肉汤营养肉汤严重污染严重污染乳糖发酵阳性管乳糖发酵阳性管菌落菌落3-5个，氧化酶阴性个，氧化酶阴性EMBMacc肠道增菌肉汤肠道增菌肉汤TSI、吲哚、尿素酶、吲哚、尿素酶、KCN、LYS、动力动力TSI底层底层+、H2S-、尿素酶尿素酶-、KCN-血清学试验血清学试验ETEC+EPEC+、EHEC+、O157HEIEC+非左非左非左非左非大肠埃希菌非大肠埃希菌肠毒素肠毒素+吲哚吲哚+、 LYS -、动动力力-、O124-/+产肠毒素大肠产肠毒素大肠埃希菌埃希菌致病性或出血致病性或出血性大肠埃希菌性大肠埃希菌侵袭性大肠埃侵袭性大肠埃希菌希菌非致泻大肠埃希非致泻大肠埃希菌菌五五 检测程序图检测程序图快速检测绿蓝色菌落为O157n红色菌落为大肠杆菌。红色菌落为大肠杆菌。n蓝色菌落为其它大肠菌群蓝色菌落为其它大肠菌群