RNA-的提取琼脂糖电泳及RTPCR.ppt

目的目的 DNA片段片段 质粒质粒 TA载体载体连接连接 重组质粒重组质粒目的目的 DNA转化转化无质粒的无质粒的E.Coli 死亡死亡有质粒的有质粒的E.Coli 存活存活含抗生素培养基中生长含抗生素培养基中生长PCR 2-3min平板筛选平板筛选 实验内容实验内容1、小鼠肝脏组织总、小鼠肝脏组织总RNA的提取；的提取；2、RNA的琼脂糖凝胶电泳；的琼脂糖凝胶电泳；3、以总、以总RNA为模板的逆转录反应；为模板的逆转录反应；4、以、以cDNA为模板的特定基因的为模板的特定基因的RT-PCR: 注：本次实验扩增注：本次实验扩增GAPDH基因基因(746bp)5、 PCR产物的电泳及回收产物的电泳及回收（8：058：15）教师要有下午电泳时教师要有下午电泳时 播放的多媒体播放的多媒体 PCR Flash 动画动画 PCR在法医学上的应用在法医学上的应用RNA提取操作注意事项提取操作注意事项 RNA RNA分离的关键因素是减少分离的关键因素是减少RNARNA酶污染。酶污染。 RNA酶是一类自然界中广泛存在、生物活性非常稳定的酶类。酶是一类自然界中广泛存在、生物活性非常稳定的酶类。环境中的灰尘、人体汗液、唾液、实验器材表面。环境中的灰尘、人体汗液、唾液、实验器材表面。RNase耐热、耐耐热、耐酸、耐碱，不需要辅助因子就具有活性作用。酸、耐碱，不需要辅助因子就具有活性作用。 1、尽量避免外源性、尽量避免外源性RNase 污染污染 a. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。操作环境空气洁净。带手套、口罩。 b. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） c.一次性塑料器材最好是新开封并经过一次性塑料器材最好是新开封并经过DEPC水处理及高压灭水处理及高压灭菌。菌。 d.玻璃器材、水都应该经过去玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。对玻处理。对玻 璃器材还应该进行高温烘烤。璃器材还应该进行高温烘烤。 2、应用、应用RNase 抑制剂抑制内源性抑制剂抑制内源性RNase 活性活性。 总总RNA 真核细胞的真核细胞的RNA主要分为：主要分为： 1、mRNA: 1-5% 起始密码：起始密码：AUG 终止密码：终止密码：UAA,UAG,UGA。 5鸟嘌呤鸟嘌呤7位甲基化位甲基化CH3修饰。修饰。 1）免受核酸酶破坏，）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。）起始、促进蛋白质合成。 3poly(A)尾巴结构尾巴结构 20-200个个A. 翻译所必需。翻译所必需。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基小亚基40S: 18S=1874nt1 1）将）将1 ml Trizol 1 ml Trizol 试剂分装到试剂分装到Eppendorf Eppendorf 管中备用。管中备用。2 2）实验教师操作实验教师操作: : 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大大, ,放在玻片上立即研磨放在玻片上立即研磨, ,研磨研磨要彻底要彻底。 3 3）将研磨后的组织（）将研磨后的组织（小米粒大小小米粒大小）转移至）转移至1 ml Trizol 1 ml Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min2 min以上，使组织细胞以上，使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4 4）室温孵育）室温孵育10 min10 min。（8：159：05）发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。强调肝脏组织块不宜过大强调肝脏组织块不宜过大,研磨要彻底。研磨要彻底。第一部分：提取小鼠肝脏组织的总第一部分：提取小鼠肝脏组织的总RNA1、异硫氰酸胍法：、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。特点：需低温操作，但价格经济。2、Trizol 试剂试剂（商品化产品）（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。3、mRNA提取试剂盒提取试剂盒 真核细胞真核细胞mRNA的的3末端有末端有ploy(A)尾，利用寡聚尾，利用寡聚 dT纤维素纤维素结合结合mRNA，将其从细胞总，将其从细胞总RNA中分离出来。中分离出来。课间介绍课间介绍 RNA提取的几种方法提取的几种方法室温孵育室温孵育10 minRNase抑制剂介绍抑制剂介绍1、DEPC, 二乙基焦炭酸盐二乙基焦炭酸盐 RNA操作时最常用的操作时最常用的RNase抑制剂，对核酸酶有抑制剂，对核酸酶有 很强的抑制很强的抑制作用。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。作用。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。 使用方法：用来去除溶液中的使用方法：用来去除溶液中的RNase 。RNA提取中提取中 所有液体试剂都应该用所有液体试剂都应该用DEPC处理。处理。 有效浓度：有效浓度：0.05%-0.1%，室温磁力搅拌，室温磁力搅拌20分钟。分钟。 灭活条件：高压消毒，或灭活条件：高压消毒，或70 C 1 h。 在在Tris溶液中半衰期为溶液中半衰期为1.25min。 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。，或液氮中。2、肝素、肝素 使用浓度：使用浓度：0.110mg/ml 效效 果果: 37 C 时，可抑制时，可抑制95%的的RNase 活力。活力。 如果与如果与DEPC联合应用，联合应用， 具有极强的抑制具有极强的抑制 效果。效果。 室温孵育室温孵育10 min 结束结束5 5）加入）加入200 200 l l氯仿，震荡混匀氯仿，震荡混匀20-30 s20-30 s，室温放置，室温放置5 min5 min （此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体）（此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体） 10, 000 rpm10, 000 rpm，离心，离心 5 min (5 min (统一离心统一离心) ) 7 7）将清澈透明的）将清澈透明的上层水相上层水相 转移至另一离心管中。转移至另一离心管中。9：0510：05RNA (清澈透明清澈透明)DNAProtein第一部分：提取小鼠肝脏组织的总第一部分：提取小鼠肝脏组织的总RNA RNA提取提取:RNA (清澈透明清澈透明)DNAProtein8 8）沉淀）沉淀RNARNA：加：加0.5 ml0.5 ml异丙醇异丙醇，上下颠倒混匀，室温，上下颠倒混匀，室温10 min10 min。 10, 00010, 000 rpmrpm，4 4 C C，( (统一统一) ) 离心离心10 min10 min，弃上清。，弃上清。1010）加）加1ml 75%1ml 75%乙醇乙醇洗涤。洗涤。1111）7500rpm7500rpm，4 4 C C 离心离心 1 min1 min，弃上清，弃上清 再离心几秒钟，将管壁液体完全移净。再离心几秒钟，将管壁液体完全移净。在用在用TriZol试剂提取总试剂提取总RNA时，全程均在室温进行，当时，全程均在室温进行，当RNA沉淀用水溶解后，沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，而且尽可能快地进入下一个环节。应该注意在冰上操作，而且尽可能快地进入下一个环节。离心离心10分钟时分钟时课间休息课间休息注意：注意：75%乙醇的作用：不起沉淀作用，只是为了清洗管壁加入方法一定是贴管壁在沉淀的对侧贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀缓慢加入，不要搅动沉淀12）室温干燥）室温干燥35 min（根据（根据RNA沉淀大小决定，干燥后的沉淀沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，避免过分干燥应该是无色胶样透明状，避免过分干燥,此此步骤非常关键步骤非常关键。）。）注意事项注意事项：RNA:自然室温干燥避免放在37oC孵箱中过度干燥以防无法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成成RT的失败，但过分干燥又是造成的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解不溶解的主要原因的主要原因 。判断。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。干燥后的是过分干燥是逆转录成功的关键环节。干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状。沉淀应该是无色胶样透明状。RNA pellet：乳白色，透明胶样乳白色，透明胶样干燥后无色透明干燥后无色透明13）用加样器吸取冰冷）用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 18 l，加到，加到RNA上，进行吹打上，进行吹打溶解溶解RNA 沉淀。沉淀。溶解的溶解的RNA应置冰上保存应置冰上保存。14) 14) 吸出吸出 9 9 l l溶液放到冰上备用溶液放到冰上备用( (将用于电泳将用于电泳).).15) 15) 剩余剩余 9 9 l l溶液溶液, ,放到冰上备用（用于放到冰上备用（用于RTRTPCRPCR）. .RNA的溶解：的溶解：v注意：注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心沉淀的溶解一定要耐心充分，充分，一定一定要用加样器要用加样器反复反复多次吹打方多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响现气泡影响RNA的溶解。的溶解。避免气泡的方法：避免气泡的方法：用加样器的第一挡用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：判断溶解程度：吹打时液体流动不拐弯吹打时液体流动不拐弯为止。为止。 逆转录酶：逆转录酶： 存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC 。 以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNAcDNA。 RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。 RT第二部分：逆转录反应第二部分：逆转录反应 (RT)AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC, annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC, RTase mRNAmRNAcDNA10min1-2h RT 按照下列配方进行按照下列配方进行RNA的的RT反应：反应：第一步：第一步：总总RNA 9 l Oligo dT (0.05 g/ml) 1 l (终：终：2.5 ng/ml) 轻弹管底混合，轻弹管底混合， 置置65水浴水浴10min后后， 立即冰浴立即冰浴2min。在水浴在水浴10分钟时，开始分钟时，开始RNA电泳。电泳。RT引物的用量非常引物的用量非常少，因为模板量是固少，因为模板量是固定的，而且只进行一定的，而且只进行一次反应。次反应。关键点：关键点：RNA是否充分溶解是否充分溶解根据组织或细胞的量确定逆转录反根据组织或细胞的量确定逆转录反应的体积，通常利用应的体积，通常利用1ml Trizol试试剂提取出来的总剂提取出来的总RNA适合于适合于20 l体体积的逆转录反应体系。积的逆转录反应体系。引物的量是否合适引物的量是否合适高温退火避免高温退火避免Oligo dT锚锭点错锚锭点错误，同时，打开误，同时，打开RNA链之间的二级链之间的二级结构，利于结构，利于RT。 退火后一定迅速放在冰上退火后一定迅速放在冰上在水浴在水浴10分钟时，开始分钟时，开始RNA电泳。电泳。 将将 RNA 进行进行 1% 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 9 l RNA 样品样品 23 l 上样液轻轻混匀，上样液轻轻混匀， 上样上样 电泳电泳: 120伏，伏，1020分钟分钟 注意注意: 电泳槽的清洁及新的电泳液！电泳槽的清洁及新的电泳液！ 琼脂糖凝胶要新鲜配制！琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结果紫外透射仪观察电泳结果RNA电泳结果电泳结果 rRNA可以作为内部可以作为内部Marker分分子，通过观察子，通过观察rRNA的两条带的两条带（28S和和18S）的比例，可以判）的比例，可以判断所提取断所提取mRNA是否存在降解。是否存在降解。 RNA电泳并不能判断电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因提取质量的常规方法，因为为在电泳过程中在电泳过程中RNA可能发生可能发生降解降解。重点讲解重点讲解28S、 18S和和5S的比例。的比例。 分析本次实验结果：分析本次实验结果：28S、 18S和和5S的比例。的比例。RNA电泳结果分析电泳结果分析第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂：第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂： 5 RT-buffer 4 l RNasin (40U/ml) 1 l dNTPs (10mmol/L) 4 l AMV 1 l轻弹管底混合，可用离心机甩一下。轻弹管底混合，可用离心机甩一下。置置42 oC 水浴水浴1h。将上述反应移至将上述反应移至68 oC水浴水浴10min以灭活以灭活 RTase，并冰浴，保存备用。，并冰浴，保存备用。（10：3011：30 由老师结束实验，放由老师结束实验，放-20 oC，下午使用，下午使用 ）cDNA 4 l10PCR buffer（含MgCl2） 5 ldNTPs (10mmol/L) 1 l5引物 (10mol/L) 1 l3引物 (10mol/L) 1 l去离子水（补足反应体系） 39 l Taq DNA pol. (2U/l) 1 l 轻弹管底混合（用离心机甩一下）轻弹管底混合（用离心机甩一下）注意：最后加入注意：最后加入Taq 酶。酶。 PCR 操作操作 50l在一微量离心管中在一微量离心管中依次依次加入下列试剂：加入下列试剂：PCR仪设定的反应条件：仪设定的反应条件：94oC 45 S DNA变性变性55 oC 45 S DNA复性复性72 oC 1 min 产物链延伸产物链延伸 25-30个循环后个循环后 72 oC 10 min 根据待扩增基因片段的长短确定具体反应条件，一般情况下，根据待扩增基因片段的长短确定具体反应条件，一般情况下，基因片段在基因片段在500-1000bp左右时，可按下列条件进行左右时，可按下列条件进行PCR。PCR仪介绍：仪介绍：如果上盖加热的如果上盖加热的PCR仪，可以直接放仪，可以直接放入仪器中进行入仪器中进行PCR；如果下面加热的如果下面加热的PCR仪，加入仪，加入2滴滴矿物油后，加入仪器中，不过这矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。种仪器现在已经很少用到。PCR反应期间讲解：反应期间讲解： 1：203：00PCR仪内发生的反应仪内发生的反应1）对于定性分析特定基因在不同样本中的表达情）对于定性分析特定基因在不同样本中的表达情 况时，一定要防止污染，尤其是况时，一定要防止污染，尤其是PCR产物的污产物的污 染，为了排除假阳性结果，各种对照是必不可染，为了排除假阳性结果，各种对照是必不可 少的。少的。2）模板不是越多越好，模板过多，当引物与模板）模板不是越多越好，模板过多，当引物与模板 退火时会发生模板先互补结合，引物无法与模退火时会发生模板先互补结合，引物无法与模 板结合，因此，适量模板量是非常重要的。板结合，因此，适量模板量是非常重要的。 模板过多还能大量消耗镁离子。模板过多还能大量消耗镁离子。PCR反应注意事项：反应注意事项： 根据待扩增基因片段的大小确定根据待扩增基因片段的大小确定延伸延伸时间，小时间，小于于500bp，一般采用，一般采用1分钟即可，大于分钟即可，大于500bp，可采，可采用用2分钟，但一般超过分钟，但一般超过2000bp，一般可适当延长延，一般可适当延长延伸时间伸时间2-3分钟。分钟。 变性变性 温度一般选用温度一般选用94 1oC，变性时间可根据，变性时间可根据模板大小和浓度确定，一般采用模板大小和浓度确定，一般采用30秒。秒。 退火退火 温度与引物序列关系非常密切，退火时温度与引物序列关系非常密切，退火时间与引物长度和间与引物长度和GC含量有关。含量有关。 引物长度一般在引物长度一般在15-25bp之间。之间。 Tm=4(G+C)+2(A+T)如何确定如何确定PCRPCR的变性、退火和延伸温度和时间？的变性、退火和延伸温度和时间？RT的引物选择：的引物选择： Oligo (dT)15-18 Specific anti-sense primer Random primer因为基因序列与因为基因序列与mRNA序列是一序列是一致的。致的。病毒病毒RNA作为作为RT模板模板时，一定要知道病毒时，一定要知道病毒是属于哪一种病毒：是属于哪一种病毒：正链正链RNA病毒？负链病毒？负链RNA病毒？病毒？正链正链RNA病毒：病毒：RT引物用引物用anti-sense primer；负链负链RNA病毒：病毒：RT引物用引物用sense primer。 1.为什么要加入镁离子？为什么要加入镁离子？ 镁离子是镁离子是Taq DNA聚合酶的辅酶，聚合酶的辅酶，2.0mM的浓度时酶活性的浓度时酶活性最高。镁离子能够和负离子集团结合，在最高。镁离子能够和负离子集团结合，在PCR反应中，模板反应中，模板DNA、引物、引物DNA、dNTP均可和镁离子结合，尤以均可和镁离子结合，尤以dNTP影响影响最大。一般镁离子应比最大。一般镁离子应比dNTP高高0.5-1.0mM。 2.dNTP的浓度对的浓度对PCR有什么影响？有什么影响？ dNTP浓度过高，除容易引起碱基错配外，还可结合镁离子。浓度过高，除容易引起碱基错配外，还可结合镁离子。 3.3.为什么有时候需要进行热启动？为什么有时候需要进行热启动？ 热启动就是让热启动就是让DNA在变性温度下开始，在变性温度下开始，Taq DNA聚合酶在聚合酶在DNA双链充分打开之后再加入双链充分打开之后再加入PCR反应体系中，这样可以保反应体系中，这样可以保证模板证模板DNA变性充分，引物结合顺利并特异。变性充分，引物结合顺利并特异。 PCRPCR反应相关问题：反应相关问题：4、DNA聚合酶：聚合酶：1）Taq DNA聚合酶的特性聚合酶的特性:半衰期：半衰期：95oC ，40分钟分钟活活 性：性：5-3方向的聚合酶活性。方向的聚合酶活性。 5-3外切酶活性。外切酶活性。 缺乏缺乏3-5外切酶活性。外切酶活性。 因此没有校正功能。因此没有校正功能。2）Vent-TM DNA聚合酶：聚合酶：半衰期：半衰期：100 oC ，95分钟分钟活活 性：还具有性：还具有3-5外切酶活性。外切酶活性。引物设计引物设计 1、GC比值：碱基对中的比值：碱基对中的GC之间有三条氢键，之间有三条氢键，AT之间有两条之间有两条 氢键，氢键，GC和和AT在引物序列中的合理比例是设定在引物序列中的合理比例是设定PCR退火温度的退火温度的 重要依据。通常在一个引物中重要依据。通常在一个引物中GC和和AT各半。各半。 2、引物特异序列的长度至少为、引物特异序列的长度至少为15-18bp。 3、引物的方向：引物的方向永远是、引物的方向：引物的方向永远是53方向，正向（方向，正向（Sense）引物是与一股模板引物是与一股模板DNA序列相一致的，而反向（序列相一致的，而反向（Antisense）引物）引物则与这股模板则与这股模板DNA序列相互补。序列相互补。 4、 引物的酶切位点：通常在引物的引物的酶切位点：通常在引物的5-端设计适当的限制端设计适当的限制 性酶切位点。两种酶切位点使克隆具有方向性。性酶切位点。两种酶切位点使克隆具有方向性。 5、引物上启始和终止密码：如果想表达、引物上启始和终止密码：如果想表达DNA片段，所片段，所 用的载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在用的载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在 引物的酶切位点之后、特异性引物的酶切位点之后、特异性DNA序列之前。序列之前。 6、如果表达的蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要、如果表达的蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要 的序列设计在引物中以使所表达的融合蛋白易于纯化。的序列设计在引物中以使所表达的融合蛋白易于纯化。引物设计方法例：引物设计方法例：通常在引物的通常在引物的5-端设计适当的限制性酶切位点端设计适当的限制性酶切位点凝胶成像系统：凝胶成像系统：凝胶成像系统：凝胶成像系统： 播放播放 PCR Flash 动画动画 PCR在法医学上的应用在法医学上的应用引物的配制：引物的配制：Primer 1:OD=5注意：注意：计算一管引物的总含量或克分子数计算一管引物的总含量或克分子数先配成先配成100mM的浓度作为储存液的浓度作为储存液工作液可以通过稀释获得工作液可以通过稀释获得如果需要反复应用的如果需要反复应用的引物，配制后一定要引物，配制后一定要分装保存，一段时间分装保存，一段时间后弃掉。后弃掉。切记：切记：不要将合成回来不要将合成回来的引物一次性配的引物一次性配成工作液！成工作液！ PCR:PCR的基本流程：的基本流程：94oC, 45 sec55oC, 1 min72oC, 2 min退火温度的变化是根据引退火温度的变化是根据引物的物的GC比例确定或估计比例确定或估计的；的；退火时间的变化是根据引退火时间的变化是根据引物的长度调整的。物的长度调整的。热启动：热启动：避免发夹结构或其避免发夹结构或其他二级结构影响引他二级结构影响引物的退火。物的退火。两种方式加入两种方式加入DNA聚合酶：聚合酶：热启动结束后暂停热启动结束后暂停PCR反应，在反应，在PCR仪仪上直接趁热加入上直接趁热加入DNA pol；热启动结束后将反应管迅速放在冰上，热启动结束后将反应管迅速放在冰上，然后加入然后加入DNA pol。