2022年分子生物学与基因工程复习资料 .pdf

分子生物学与基因工程绪论1、 分子生物学与基因工程的含义从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。基因工程是一项将生物的某个基因通过载体运送到另一种生物的活体细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。2、 分子生物学与基因工程的发展简史，特别是里程碑事件，要求掌握其必要的理由上个世纪50 年代， Watson 和 Crick 提出了的DNA 双螺旋模型；60 年代，法国科学家Jacob和 Monod 提出了的乳糖操纵子模型；70 年代，Berg 首先发现了DNA 连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA 分子；80 年代， Mullis 发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术；90 年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用。核酸概述1、核酸的化学组成2、核酸的种类与特点：DNA 和 RNA 的区别（1）DNA 含的糖分子是脱氧核糖，RNA 含的是核糖；名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 23 页 - - - - - - - - - （2）DNA 含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（ C）、鸟嘌呤（ G）和胸腺嘧啶（ T），RNA 含有的碱基前3 个与 DNA 完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替；（3）DNA 通常是双链，而RNA 主要为单链；（4）DNA 的分子链一般较长，而RNA 分子链较短。3、DNA 作为遗传物质的直接和间接证据；间接：（1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA 含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA 含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA 含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。（2）DNA 在代谢上较稳定。（3）DNA 是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。（4）DNA 通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA 。（5）在各类生物中能引起DNA 结构改变的化学物质都可引起基因突变。直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验4、DNA 的变性与复性：两者的含义与特点及应用变性：它是指当双螺旋DNA 加热至生理温度以上（接近100oC）时，它就失去生理活性。这时DNA 双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。简而言之，就是DNA 从双链变成单链的过程。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 23 页 - - - - - - - - - 增色效应：它是指在DNA 的变性过程中，它在260 nm 的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升的效应。复性：它是指热变性的DNA 如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋的过程。复性的速度与DNA 的浓度有关， 因为两互补序列间的配对决定于它们碰撞频率。DNA 复性的应用 -分子杂交：由DNA 复性研究发展成的一种实验技术是分子杂交技术。杂交可发生在DNA 和 DNA 或 DNA 与 RNA 间。5、Tm 的含义与影响因素Tm 的含义：是指吸收值增加的中点。影响因素：1）DNA 序列中 G + C 的含量或比例含量越高， Tm 值也越大（决定性因素）；2）溶液的离子强度3）核酸分子的长度有关：核酸分子越长，Tm 值越大4）某些化学物质5）溶液 pH 值6、DNA 的一级结构的含义与特点，包括化学本质7、DNA 双螺旋模型的发现过程、基本内容与生物学意义（1）两条多核苷酸链以右手螺旋的形式彼此以一定的空间距离，平行地环绕于同一轴上；（2）两条多核苷酸链走向为反向平行，即一条链磷酸二酯键为53方向，而另一条为3一 5方向，二者刚好相反；名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 23 页 - - - - - - - - - （3）每条长链的内侧是扁平的盘状碱基，碱基一方面与脱氧核糖相联系，另一方面通过氢键与它互补的碱基相联系。互补碱基对A 与 T 之间形成两对氢键，而C 与 G 之间形成三对氢键。上下碱基对之间的距离为0.34nm；（4）每个螺旋为3.4nm 长，刚好含有10 个碱基对，其直径约为2nm；（5）在双螺旋分子的表面大沟和小沟交替出现。3、 DNA 精细结构的含义与重要参数（1）依赖于序列的B-DNA 构象变化；（2）连续 AT 序列的构象；（3）含错配碱基对的B-DNA ；（4）DNA 的局部构象与DNA 结合蛋白4、 DNA 超螺旋结构的形成与鉴定超螺旋 DNA 可采取两种拓扑学上相当的形式。一种相当于双螺旋绕圆柱体旋转；另一种相当于双螺旋相互盘绕。超螺旋的这两种形式可以相互转变。天然的DNA 都呈负超螺旋，但在体外可得正超螺旋5、 DNA 不寻常结构有哪些，有何作用？交替的嘧啶、嘌呤重复序列倾向形成Z-DNA反向重复序列倾向形成十字形结构构成镜像重复的同型嘧啶-同型嘌呤序列可能形成三链结构：在形成三链DNA 过程中游离出来的多聚嘌呤链则保持单链状态。故三链 DNA 对 S1 核酸酶的作用敏感。由于三链DNA 含名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 23 页 - - - - - - - - - 有镜像重复，故可形成两种异构体：一是多聚嘌呤链的5部分成单链；另一是3部分成单链。富含 G 的序列可能形成四链结构：端粒 DNA 的序列具有一定的取向特征。在每一染色体末端，富含 G 的一股链由5向 3-末端延伸， 并突出于互补的富含C 一股链 1216 核苷酸。染色体的末端与特定的蛋白质形成复合物。染色体与基因组的结构1、 真核生物染色体的结构，包括基本单元的化学组成染色体是由染色质构成的，染色质是由DNA 、RNA 和蛋白质形成的复合体。染色体是动态的物体，其外观随细胞周期的不同阶段发生明显的改变。仅当细胞分裂时，每个染色体才呈现出凝聚型。（1）组蛋白：组蛋白在翻译后是受到修饰的，其中包括特异精、组、赖、丝和苏氨酸残基的甲基化、乙酰基化和磷酸化（2）核小体（3）30 nm 纤丝（4）辐射的环2、 真核生物基因组的C 值与特点在真核生物中，每种生物的单倍体基因组的DNA 总量是恒定的，称之为C 值。3、 基因组中 DNA 的大小、形状与序列组织：包括卫星DNA 和微卫星 DNA 的含义DNA一般为长而无分支的双股线性分子，但有些为环型，也有少数为单股环型。不同的 DNA 大小相差悬殊。 例如，SV40 含 5.1 kb，而南美肺鱼的基因组含102 000 000 kb。虽然一般而言，复杂的有机体需要更多的DNA ，但不存在严格的对应关系。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 23 页 - - - - - - - - - 真核生物 DNA 碱基组成上的异质性主要由于存在着以下3 类 DNA 序列：高度重复序列；中度重复序列；单一序列。4、 真核生物的基因组特点（与原核生物比较）真核生物基因组与原核生物的相比，主要有以下几方面的差异（特点）：（1）分布部位（2）基因特性（3）遗传信息的传递过程（4）自身的复制过程蛋白质的结构与功能1、蛋白质的含义蛋白质一词最早来自希腊语“proteios”，其含义为“第一重要的”。现代科学研究表明，蛋白质是由20 种左右的-氨基酸通过肽键相互连接而成的一类具有特定的空间构象和生物学功能的高分子有机化合物。1、二十种氨基酸的英文简称，要求掌握一个字母的含义名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 23 页 - - - - - - - - - 1、蛋白质一级结构的含义它是指蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序，也是蛋白质最基本的结构。它是由基因上遗传密码的排列顺序所决定的。各种氨基酸按遗传密码的顺序，通过肽键连接起来，成为多肽链，故肽键是蛋白质结构中的主键。2、蛋白质二级结构的类型，包括阿尔法结构与DNA 双螺旋的异同点-螺旋、 -折迭、 -转角、无规则卷曲（填空题）（1）多个肽键平面通过-碳原子旋转，相互之间紧密盘曲成稳固的右手螺旋；（2）主链呈螺旋上升，每 3.6 个氨基酸残基上升一圈，相当于 0.54nm，这与 X 衍射图符合；（3）相邻两圈螺旋之间借肽键中C O 和硫氢基形成许多链内氢健，即每一个氨基酸残基中的 NH 和前面相隔三个残基的CO 之间形成氢键，这是稳定-螺旋的主要键；（4）肽链中氨基酸侧链R 分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响-螺旋的形成。酸性或碱性氨基酸集中的区域，由于同电荷相斥，不利于-螺旋形成；较大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸)集中的区域， 也妨碍 -螺旋形成； 脯氨酸因其 -碳原子位于五元环上，不易扭转，加之它是亚氨基酸，不易形成氢键，故不易形成上述-螺旋；甘氨酸的R基为 H，空间占位很小，也会影响该处螺旋的稳定。1、蛋白质结构与功能的关系（1）蛋白质一级结构与功能的关系：蛋白质一级结构是空间结构的基础，特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R 基团形成的次级键来维持，在生物体内，蛋白质的多肽链一旦被合成后，即可根据一级结构的特点自然折叠和盘曲，形成一定的空间构象。（2）蛋白质空间构象与功能活性的关系：蛋白质多种多样的功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关，蛋白质的空间构象是其功能活性的基础，构象发生变化， 其功能活性也名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 23 页 - - - - - - - - - 随之改变。 蛋白质变性时，由于其空间构象被破坏，故引起功能活性丧失，变性蛋白质在复性后，构象复原，活性即能恢复。血红蛋白是红细胞中所含有的一种结合蛋白质，它的蛋白质部分称为珠蛋白，非蛋白质部分 (辅基 )称为血红素（ x）DNA 复制1、一些基本概念：复制子、复制单元、复制起始点、半保留复制、半不连续复制、前导链、随后链、冈崎片段。DNA 在复制时首先两条链之间的氢键断裂使两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA 链，这样新合成的子代DNA 分子中一条链来自亲代DNA ，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。连续合成的链比不连续合成的链超前一步，称为前导链。2、不连续合成的链要滞后一步，称为后随链。前导链连续复制和后随链的不连续复制，称为DNA 的半不连续复制。随从链的前进方向是与复制叉的打开方向相反的。随从链只能先以片段的形式合成，这些片段就叫做冈崎片段。复制是从 DNA 分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点。生物体的单个复制单位称为复制子。1、要求掌握 DNA 定点双向复制名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 23 页 - - - - - - - - - 4、单链结合蛋白的作用它与解开的单链DNA 结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA 的水解，保证了单链DNA 做为模板时的伸展状态，SSBP 可以重复利用。5、DNA 复制的酶学基础及原核生物复制的一般过程，包括DNA 复制前导链和随后链的起始、延长和终止6、真核生物DNA 复制的特点（1）与原核生物不同，真核生物DNA 复制有许多起始点（2）在真核生物DNA 复制叉处，需要两种不同的酶。（3）由于真核生物染色体是线性DNA ，它的两端叫做端区，端区是由重复的寡核苷酸序列构成的。（4）真核生物具有多重复制原点，原核生物只有一个。RNA 生物合成及其加工1、一些基本概念：不对称转录、编码链（信息链）、模板链、启动子、转录因子在 DNA 的两条多苷酸链中只有其中一条链作为模板，这条链叫做模板链，又叫反义链。DNA 双链中另一条不做为模板的链叫做编码链，又叫有意义链。编码链的的序列与转录本RNA 的序列相同，只是在编码链上的T 在转录本 RNA 为 U，由于 RNA 的转录合成是以DNA 的一条链为模板而进行的，所以这种转录方式又叫做不对称转录。启动子： 指 DNA 分子上被RNA 聚合酶识别并结合形成转录起始复合物的区域，还包括名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 23 页 - - - - - - - - - 一些调节蛋白因子的结合序列。转录因子：凡是转录起始过程必需的蛋白质，只要不是RNA 聚合酶的组成成分，就可以将其定义为转录因子。2、RNA 生物合成的酶学基础：包括该酶的组成与特点3、原核生物DNA 转录的基本过程，包括启动子的识别、起始、延长和终止4、真核生物转录与原核生物的区别5、原核生物转录与复制的主要区别6、mRNA 加工基本过程：要求掌握帽子与尾巴结构的名称与作用及形成过程?5 端形成帽子结构 (m7GpppNp )?3 端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail)?中部剪接除去内含子?链内部核苷酸的甲基化mRNA 帽子的生理功能：帽子结构参与翻译起始，帽0结构是核糖体识别mRNA 所名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 23 页 - - - - - - - - - 必需的；核糖体上有帽结合蛋白。 帽子结构增加mRNA 的稳定性，保护mRNA 防止其受 5核酸外切酶的降解。促进某些RNA 的合成。7、tRNA 加工基本过程：要求掌握氨基酸臂名称、加工酶系及碱基修饰方式 剪切内含子 核酸外切酶修剪3末端，逐个切去附加序列； 加上 CCA-OH 的 3末端，完成柄部结构。 碱基修饰蛋白质生物合成1、蛋白质合成的物质基础包括哪些方面（1）合成原料（2）mRNA 是合成蛋白质的直接模板（3）tRNA 是氨基酸的运载工具（4）核糖体 -蛋白质的合成场所（5）蛋白质生物合成的必需因子2、遗传密码的特点及解析（1）起始码：绝大多数生物的起始密码子都是AUG ，作为多肽链合成的起始信号，同时编码一种氨基酸，原核生物的起始密码子AUG 翻译对应的是甲酰甲硫氨酸，真核生物的起始密码子AUG 翻译对应的是甲硫氨酸。（2）终止码：密码子 UAA 、UAG 、UGA 并不编码任何氨基酸，起着终止肽链合成的作用，因此成为终止密码子。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 23 页 - - - - - - - - - （3）密码无标点符号（4）密码的简并性：简并性主要是由于密码子的第三个碱基发生摆动现象形成的，也就是说密码子的专一性主要由前两个碱基决定，（5）密码的通用性：蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。但已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。3、核糖体作为蛋白质或多肽装配机器的原因核糖体作为蛋白质的合成场所，它提供了模板mRNA 的结合位点、肽酰基 tRNA 位、氨基酰 tRNA 位、转肽酶活性部位及蛋白质合成起始因子IF、延长因子EF 和终止因子RF 的结合部位。4、原核生物蛋白质合成的基本过程，包括氨基酸的活化、合成的起始、多肽链的延长与释放。5、多核糖体循环的含义事实上在细胞内一条mRNA 链上结合着多个核糖体，甚至可多到几百个。蛋白质开始合成时，第一个核糖体在mRNA 的起始部位结合，引入第一个蛋氨酸，然后核糖体向mRNA的 3端移动一定距离后，第二个核糖体又在mRNA 的起始部位结合，向前移动一定的距离后， 在起始部位又结合第三个核糖体，依次下去，直至终止。两个核糖体之间有一定的长度间隔，每个核糖体都独立完成一条多肽链的合成，所以这种多核糖体可以在一条mRNA链上同时合成多条相同的多肽链，这就大大提高了翻译的效率。基因表达调控名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 23 页 - - - - - - - - - 1、一些基本概念：基因表达、基因表达组织特异性、基因表达阶段特异性、组成性表达、适应性表达、顺式作用元件、反式作用元件（1）基因表达：指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。（2）基因表达组织特异性：遗传信息的表达是受到严格调控的，通常各组织细胞只合成其自身结构和功能所需要的蛋白质。不同组织细胞中不仅表达的基因数量不相同，而且基因表达的强度和种类也各不相同，这就是基因表达的组织特异性。（3）基因表达阶段特异性：细胞分化发育的不同时期，基因表达的情况是不相同的，这就是基因表达的阶段特异性。（4）组成性表达：指不大受环境变动而变化的一类基因表达。（5）适应性表达：指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。（6）顺式作用元件：指DNA上对基因表达有调节活性的某些特定的调节序列，其活性仅影响与其自身处于同一分子的基因。（7）反式作用元件：调控基因可以在结构基因群附近、也可以远离结构基因，它是通过其基因产物 -调控蛋白来发挥作用的，因而调控基因不仅能对同一条DNA 链上的结构基因起表达调控作用，而且能对不在一条DNA 链上的结构基因起作用，在遗传学实验上称为反式作用，调控基因就属于反式作用元件。2、乳糖操纵系统的组成部分及作用乳糖操纵元含有z、y 和 a 三个结构基因。z 基因长 3510bp，编码含 1170 个氨基酸、分子量为 135kD 的多肽， 以四聚体形式组成有活性的-半乳糖苷酶， 催化乳糖转变为别乳糖，再分解为半乳糖和葡萄糖；y 基因长780bp，编码由260 个氨基酸组成、分子量30kD 的半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；a 基因长 825bp，编码含 275 氨基酸、分子量为名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 13 页，共 23 页 - - - - - - - - - 32kD 的转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。3、乳糖操纵子模型的基本内容及在分子生物学中的地位操纵元是原核基因表达调控的一种重要的组织形式，大肠杆菌的基因多数以操纵元的形式组成基因表达调控的单元。在分子生物学中的地位：重要的里程碑4、真核生物基因表达调控的特点（与原核生物比较）（1）真核基因表达调控的环节更多（2）真核基因的转录与染色质的结构变化相关（3）真核基因表达以正性调控为主基因操作工具酶1、一些基本概念：工具酶、粘性末端、平末端、同位酶、同尾酶、同裂酶、酶活力单位（1）工具酶：在DNA分子水平的操作中，依赖于一些重要的酶，如限制性核酸内切酶、连接酶等，作为工具对DNA 进行切割和拼接，这些酶统称为基因工程工具酶（2）黏性末端：大多数限制性核酸内切酶并不是在DNA两条链的同一个位置切断，而是在两条链错开24 个核苷酸切断， 这样产生的DNA 末端会带有5 突出或是 3 突出的 DNA单链，这种末端称为黏性末端。（3）平末端：有些限制性核酸内切酶能够在识别序列中间的同一个位置将DNA 双链切断，产生的 DNA 末端是平末端。（4）同位酶：识别相同的序列但切割位点不一样的限制性核酸内切酶。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 14 页，共 23 页 - - - - - - - - - （5）同尾酶 :许多不同的限制性核酸内切酶识别序列虽然不完全相同，但切割DNA 产生的末端是相同的，这些酶统称为同尾酶。（6）同裂酶：具有相同识别序列的限制性核酸内切酶称为同裂酶。（7）酶活力单位： 在适当的反应条件下(包括温度、 pH 和离子强度等 ),1h 内在 50l 容积中完全酶解1g 特定 DNA 底物 (通常用 DNA) 所需要的酶量。2、基因操作工具酶的分类与举例说明（1）限制性内切酶：根据结构和功能的特异性，即其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，可将已发现的内切核酸酶分为三类：即I 型、 II 型、 III 型酶I 型和 III 型酶在同一蛋白酶分子中兼有甲基化酶及限制性内切核酸酶活性，又因其识别位点与切割位点不固定，所以价值不大II 型酶切割 DNA 片断活性和甲基化作用是分开的，且核酸内切作用又具有序列特异性，在基因克隆中广泛使用通常所用的限制性内切核酸酶是指II 型的（2）DNA 聚合酶大肠杆菌DNA 聚合酶 I；Klenow DNA 聚合酶； T4 DNA 聚合酶； T7 噬菌体 DNA聚合酶；耐热DNA 聚合酶；逆转录酶（3）DNA 连接酶T4 DNA 连接酶；大肠杆菌DNA 连接酶： T4 RNA 连接酶3、限制性内切酶的含义、分类、命名、特点与影响因素名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 15 页，共 23 页 - - - - - - - - - 含义：是一类能够识别双链DNA 分子中某些特定的核苷酸序列，并在该序列切割DNA 双链的核酸内切酶。分类： 按水解断裂分子的方式不同，核酸酶可分为2 种类型： 一类是从核酸分子的末端开始逐个消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶；另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂成小片段， 叫做核酸内切酶。科学家们根据酶分子结构和功能特性的差异，又把限制性核酸内切酶分为3 种类型： I 型酶、 II 型酶、 III 型酶。命名：采用Smith 和 Athens 提议的方案，根据限制性内切核酸酶来源和菌株进行命名用来源细菌的英文缩写斜体符号命名；它的第一个字母大写，来源细菌属名的第1 个字母；第二、三字母小写，来源细菌种名的头2 个字母；第四个字母代表菌株；最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号。特点：专一性: 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA 分子多样性 : 限制酶有200 多种影响因素：星活性DNA 样品的纯度 DNA 的甲基化程度DNA 的分子结构侧翼序列长度4、DNA 连接酶的含义、种类及作用机理含义：催化DNA 上裂口两侧 (相邻 )核苷酸裸露的3羟基和 5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。种类： T4 DNA 连接酶；大肠杆菌DNA 连接酶： T4 RNA 连接酶名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 16 页，共 23 页 - - - - - - - - - 连接酶的作用：在双链DNA 中， DNA 连接酶能催化具有邻近3-羟基和 5-磷酸基的单链形成磷酸二酯键，促使具有互补粘性末端或平末端的载体和供体DNA 片段连接，使之成为一个完整的重组DNA 分子。连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。结果：黏性末端（包括平末端）连接起来。基因操作载体1、载体的含义与特点含义：携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和表达的工具称载体(Vector);即用于克隆、运载和转移目的基因并能自我复制的DNA 分子。载体特点：（1）能在宿主细胞中复制并稳定地保存-具复制原点。 :在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能与携带的外源DNA 一起复制（2）能与目的基因连接- 具多个限制酶切点，而每一个这样的酶切位点在载体DNA中只有一个（广泛、特异）（3）便于筛选鉴定 -具有标记基因， 这种选择标记基因通常是抗抗菌素基因或某种酶基因，而宿主细胞并不具有（4）操作简单 -分子量小 ,高拷贝数，转化效率高,容易从宿主细胞中分离纯化2、载体的主要类型 细菌质粒载体（10kb) 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 17 页，共 23 页 - - - - - - - - - 包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体 噬菌体衍生载体(9-23kb) 柯斯质粒 (Cosmid) 载体(40-50kb)一种由质粒和噬菌体cos 尾巴构建复合载体 M13 载体一类专门用于Sanger法测序的载体 Phagemid 载体一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合载体3、质粒载体的特点与作用4、蓝白斑筛选的基本原理pUC18/pUC19 上含有一个LacZ 基因的调控序列和编码-半乳糖苷酶N 端 146 个氨基酸的序列（ -互补肽）的DNA 序列（标记为lacZ），多克隆位点就存在于lacZ上。-半乳糖苷酶的C 端编码基因却位于相应的宿主菌上。当这两个部分基因产物（缺陷型-半乳糖苷酶） 结合才会形成一个有活性的-半乳糖苷酶。这种机制称为-互补作用。5、基因表达载体与克隆载体的区别克隆载体是在克隆过程中用到的各种质粒，比如为了扩增目的基因的高拷贝质粒、为了方便测序的测序质粒、为了连接PCR 产物的 TA 质粒、为了重组的穿梭质粒等等。克隆载体一般有较强的复制能力，利于基因的保存和扩增，而且提供丰富的酶切位点等等。它不必有强启动子，因为不重于表达。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 18 页，共 23 页 - - - - - - - - - 表达载体是基因克隆结束后，为了在特定细胞内表达而构建的。他重点在于表达，有各种各样的启动子适应于不同种类的细胞，并且有各种各样，如诱导等可控的表达调控方式。6、真核生物载体（pEGFP-N1 载体）的类型与特点从结构上看， 该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；含有高效的功能强大的启动子SV40 和 PCMV ， 可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；具有多克隆位点，便于目的基因的插入；该载体具有neo 基因，可以采用G418 来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。基因操作常用技术1、分子杂交技术的分类及基本原理原理： 核酸分子杂交是指来源不同的具有互补序列的两条核酸单链，在一定条件下， 按碱基配对原则结合成杂化双链的过程。杂交的双方分别称为探针和待测核酸。2、PCR 技术的基本原理（包括反应体系和反应进程）PCR 反应体系主要由寡核苷酸(引物 )、4 种 dNTP、Taq DNA 聚合酶、 靶序列 DNA 和 PCR 反应缓冲液体系组成。94预变性510min ，94变性 30s2min，退火30s2min，72延伸 15min72延伸 510min，中间三步循环，具体时间依自己的模板和引物情况而定。3、PCR 的主要类型及应用（1） 反转录 PCR（RT-PCR）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 19 页，共 23 页 - - - - - - - - - 反转录 PCR 即以 mRNA 作为模板，进行反转录合成cDNA 的 PCR 方法其样品模板为mRNA 。一般分两步进行：第一步用反转录酶将RNA 反转录成 cDNA ，第二步以 cDNA 为模板进行PCR 扩增目前已发现一种rTth 酶，既有反转录酶活性又有DNA 聚合酶活性。 因此做 RT-PCR 可简单到用一种酶和一种缓冲体系在一个反应管内直接扩增RNA（2）巢式 PCR巢式 PCR 是指用两对引物先后扩增同一样品的方法。先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段DNA ，再用一对内侧引物以大片段DNA 为模板扩增目的基因优点：较常规PCR 灵敏度大大提高，同时第二次扩增又可鉴定第一次扩增产物的特异性用于临床检验（如血清中丙型肝炎的检测）（3）多重 PCR在反应中用多组引物同时扩增基本称复合PCR在同一反应中加入多对引物，以一个DNA 分子为模板 ,同时扩增几种不同序列的PCR 片段的方法用于同一病原体分型及同时检测多种病原体；多点突变性分子病的诊断（4） 荧光定量PCR是用 PCR 方法对样品起始模板浓度进行定量分析的一种方法通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR 产物进行标记跟踪，结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品的初始模板量用这一方法对组织细胞中的特定mRNA 进行定量分析，从而了解某一基因的表达水平。（5）原位 PCR名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 20 页，共 23 页 - - - - - - - - - 利用 PCR 技术在细胞涂片或组织切片上直接对靶DNA 片段进行扩增，然后再用原位杂交对扩增产物进行定量分析的一种方法原位 PCR 与 PCR 相比，不需抽提组织细胞中的核酸，形态结构不被破坏；比原位杂交灵敏度一般可提高100 倍。4、影响 PCR 的主要因素1、预变性2、循环中的变性步骤3、引物退火4、引物延伸5、循环数6、最后延伸5、两种 DNA 测序技术的基本原理与比较6、生物芯片技术的种类与特点生物芯片的主要特点：高通量、微型化和自动化生物芯片主要分为基因芯片和蛋白芯片基因操作1、一些基本概念：分子克隆、基因文库、基因组文库、cDNA文库、转化、转导、转染、同源重组。分子克隆： 为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA 重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA 片段。基因文库：是通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA 片段而构成的克隆集合体。基因组文库： 含有某种生物体 （或组织、 细胞） 全部基因的随机片段的重组DNA 克隆群体。cDNA 文库：将生物某一组织细胞中的总mRNA 分离出来作为模板，在体外用反转录酶合成互补的双链DNA ，而后接到合适的载体上，导入受体细胞后形成的所有克隆就叫cDNA名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 21 页，共 23 页 - - - - - - - - - 文库。转化：将质粒载体DNA 分子或其它外源DNA 导入感受态原核细胞（大肠杆菌）的过程。转导：把以噬菌体为载体的重组DNA 分子引入受体细胞的过程。转染：是感受态的细胞捕获和表达噬菌体DNA 分子的基因转化方法。同源重组； 指发生在非姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA 分子之间或分子内的重新组合。2、目的基因克隆的常见几种方法（1）从蛋白质水平分离目的基因（2）从 mRNA 水平分离目的基因（3）从 DNA 水平分离目的基因3、基因组文库的构建过程（1）供体生物基因组DNA 的制备 ,尽量提取大分子量的比较纯合的基因组DNA（2）限制性核酸内切酶部分酶切后，分离选择具有一定长度（15-20kb）的 DNA 片段（3）在体外将代表该生物完整基因组的所有DNA 片段与合适的载体连接成重组分子（4）根据所用载体，选择相应的宿主细胞（大肠杆菌）（5）导入受体细胞4、cDNA 文库的构建过程（1）分离细胞总RNA ，然后利用真核mRNA 分子的 3端多聚 A 结构将 mRNA 从 tRNA和 rRNA 中分离出来（2）以 mRNA 为模板逆转录合成cDNA 第一条链（3）合成 cDNA 第二条链有两种方法:一是用大肠杆菌的RNaseH 切割 RNA -DNA 杂交分子产生 RNA 短片段， DNA 聚合酶 I 以 RNA 短片段为引物合成新的DNA 链;二是利用cDNA名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 22 页，共 23 页 - - - - - - - - - 第一链的3端出现的发夹环结构，即第一链末端返折为合成cDNA 第二条链提供引物（4）这些体外合成的cDNA 经两端补齐后而具平头末端，在cDNA 分子的两端与带有限制性核酸内切酶位点的人工接头连接，然后酶切后与载体(通常是噬菌体)连接，导入大肠杆菌，即得cDNA 文库。5、几种常见的遗传转化方法基因枪转化技术、原生质体培养、农杆菌介导转化、真核转基因受体基因操作的基本流程1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 23 页，共 23 页 - - - - - - - - -