动物组织基因组DNA的提取.doc

如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流动物组织基因组DNA的提取【精品文档】第 3 页实验一 动物组织基因组DNA的提取一、 实验目的掌握从动物组织中提取总DNA的方法。二、 实验原理DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等实验，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提，因此基因组DNA的提取也是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作之一。染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。整个实验可分为细胞裂解、DNA分离与纯化和DNA的洗脱收集。1.细胞裂解：酶法（蛋白酶K）。2. DNA分离与纯化：细胞破碎后，常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化DNA，主要有硅基质材料、阴离子交换树脂和磁珠等。本实验采用TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒中的硅基质材料的离心吸附柱。硅基质材料吸附核酸的原理，主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合，在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征，高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。三、 材料、试剂和设备1. 材料：动物组织2. 试剂：TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，无水乙醇等3. 设备：离心机，微量移液器等四、 实验步骤1. 处理材料：取动物组织10mg，尽量切碎，加200l缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。2. 加入20l蛋白酶K溶液，混匀后56水浴，直至组织溶解（不同组织裂解时间不同，通常需1-3小时即可完成）。简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。（细胞裂解）3. 加入200l缓冲液GB，充分颠倒混匀，70放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。（溶解DNA）注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。4. 加入200l无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。（沉淀DNA）5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12,000rpm（13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。（吸附沉淀）6. 向吸附柱CB3中加入500l缓冲液GD （使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。7. 向吸附柱CB3中加入700l漂洗液PW （使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。8. 向吸附柱CB3中加入500l漂洗液PW，12,000rpm（13,400×g）离心30s，倒掉废液。（6、7、8为漂洗）9. 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm（13,400×g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的PCR等实验。10. 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200l洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm（13,400×g）离心2min，将溶液收集到离心管中。（溶解洗脱DNA）注意：采用硅基质膜吸附的DNA，可将DNA在低盐高pH值条件下洗脱下来。pH值在7.0-8.5之间洗脱效率较高，pH值低于7.0则洗脱效率很低。洗脱缓冲液体积不应该少于50l，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min， 12,000rpm（13,400×g）离心2min。DNA产物应保存在-20，以防止DNA降解。