2022年2022年核酸、核苷酸的基本换算 2.pdf

核酸、核苷酸的基本换算DNA 电泳基本参数Pfu DNA 聚合酶BCIP/NBT & BCIP/INTHistoChoice MBHistoChoice Clearing Agent 核酸、核苷酸的基本换算1 核酸的换算：(1)摩尔数与质量：1 g 1,000bp DNA = 1.52 pmol 1 g pUC18/19 DNA (2,688bp) = 0.57 pmol 1 g pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol 1 g SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol 1 g FX174 DNA (5,386bp) = 0.28 pmol 1 g M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 0.21 pmol 1 g l phage DNA (48,502bp) = 0.03 pmol 1 pmol 1,000bp DNA = 0.66 g 1 pmol pUC18/19 DNA (2,688bp) = 1.77 g 1 pmol pBR322 DNA (4,361bp) = 2.88 g 1 pmol SV40 DNA (5,243bp) = 3.46 g 1 pmol FX174 DNA (5,386bp) = 3.54 g 1 pmol M13mp18/19 DNA (7.250bp) = 4.78 g 1 pmol l phage DNA (48,502bp) = 32.01 g (2)光吸收值与浓度：1 OD260 dsDNA = 50 g/ml = 0.15 mmol/L 1 OD260 ssDNA = 33 g/ml = 0.10 mmol/L 1 OD260 ssRNA = 40 g/ml = 0.12 mmol/L 1 mmol/L dsDNA = 6.7 OD260 1 mmol/L ssDNA = 10.0 OD260 1 mmol/L ssRNA = 8.3 OD260 (3)分子量：1 个脱氧核糖核酸碱基的平均分子量为333 Daltons 1 个核糖核酸碱基的平均分子量为340 Daltons (4)核酸末端浓度：环状 DNA pmol ends = pmol DNA number of cuts 2 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 3 页 - - - - - - - - - 线性 DNApmol ends = pmol DNA (number of cuts 2 + 2) 1 g 1,000 bp DNA = 3.04 pmol ends 1 g pUC18/19 DNA (2,688 bp) = 1.14 pmol ends 1 g pBR322 DNA (4,361 bp) = 0.7 pmol ends 1 g SV40 DNA (5,243 bp) = 0.58 pmol ends 1 g FX174 DNA (5,386 bp) = 0.56 pmol ends 1 g M13mp18/19 DNA (7.250 bp) = 0.42 pmol ends 1 g l phage DNA (48,502 bp) = 0.06 pmol ends 2 核苷酸的换算：(1)分子量： MW (Da) = 333 N (number of bases) (2)浓度：C (mol/L or pmol/ml) = OD260 / (0.01 N)C (ng/ml) = OD260 MW / (0.01 N) MW - molecular ；weightN - number of bases；OD260 - absorbance at 260 nm (3)双链 DNA 与寡核苷酸的熔点短于 25bp 的双链寡核苷酸Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C) 长于 25bp 的双链寡核苷酸Tm = 81.5 + 16.6 ( lgJ+ ) + 0.41 (%GC) - (600/N) - 0.63 (%formamide)N - 引物的长度 (以碱基数计算)J+ - 单价阳离子浓度(4)DNA 与表达蛋白之间分子量换算1 kb DNA = 333 amino acid 3.7 104 Da 10,000 Da Protein 270 bp DNA 30,000 Da Protein 810 bp DNA 50,000 Da Protein 2701 bp DNA 100,000 Da Protein 27 kb DNA 3DNA 电泳基本参数1琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中DNA 迁移率（线性DNA 分离建议凝胶浓度）分离范围(bp) 琼脂糖浓度分离范围 (bp) PAGE 浓度1,000 30,000 0.5% 100 1,000 3.5% 80012,000 0.7% 80500 5.0% 50010,000 1.0% 60400 8.0% 4007,000 1.2% 40200 12.0% 2004,000 1.5% 5100 20.0% 50 2,000 2.0% 4 性、非变性PAGE 胶中染料迁移率PAGE 浓度溴酚蓝二甲苯青（相当核苷酸片段大小，bp）3.5% 100 460 5.0% 65 260 8.0% 45 160 12.0% 20 70 15.0% 15 60 20.0% 12 45 5Pfu DNA 聚合酶一、简介： Pfu DNA 聚合酶 (Pfu DNA Polymerase，Pfu) 是从高温嗜热菌Pyrococcus furiosis分离出的高保真（High Fidelity ）耐高温DNA 聚合酶。 Pfu 酶能纠正DNA 扩增（ PCR）过程中产生的错误，而传统的Taq DNA 聚合酶 (Taq DNA Polymerase，Taq) ，Tth DNA名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 3 页 - - - - - - - - - 聚合酶及它们的变体如AmpliTaq ， KlenTaq 等都不能。高温DNA 聚合酶 Vent 、DeepVent 、 Tli、Pwo、Pfu、UlTma 等都具有校正功能（Proof reading ），但 Pfu 酶是迄今发现的所有高温DNA 聚合酶中在扩增DNA 时出错率（ error rate ）最低的。它比Taq 及变体低近10 倍，比 Vent 和 Pwo 低 2-4 倍。 Pfu 酶的超常纠错特性是由该酶本身的性质决定的。其它高温DNA 聚合酶与Pfu 酶混合使用，可以部分降低产品的错误率，但效果却达不到单独使用Pfu 酶时的高保真率。在基因克隆、 表达和基因突变分析等现代分子生物学实验操作中，由于对DNA 扩增产物的正确率要求非常高，一般认为 Pfu 酶可取代Taq 成为首选高保真高温DNA 聚合酶。二、浓度 : 2.5-5U/l 三、活性定义：1 单位 Pfu 酶定义为在72，30 分钟内将10nmol 同位素标记的4 dNTP 掺入到 DE81 纸不溶物质中所需 Pfu 酶的量。 四、10PCR 反应缓冲液：100mM KCl ， 160mM (NH4),2SO4 ，20mM MgSO4 ， 200mM Tris HCl，pH8.8， 1% Triton X-100 ，1 mg/ml BSA 五、质量控制：经过检测无外源核酸酶活性；SDS-PAGE 检测纯度大于95%； PCR 方法检测无外源DNA ； 能从 100ng lambda模板中扩增出1kb 和 2kb 的单拷贝基因。 六、储存条件：Pfu 酶成品保存于50mM Tris HCl，pH8.2，0.1 mM EDTA ，0.1% Tween-20，0.1% NP-40，1 mM DTT 和 50% glycerol ， -20，一年以上。七、主要应用领域：1、常规 PCR2、基因的高保真扩增、克隆和表达3、基因的定点突变4、细胞内基因突变分析八、主要技术参数：Pfu 酶来源于高温嗜热菌Pyrococcus furiosis。分子量为90KD ；PCR 产物为平端，无 3端的单个dA；有 3?5外切核酸酶活性（高保真）；无 5 3外切核酸酶活性；DNA 聚合时的延伸速度为每分钟600 个碱基；最佳温度 65-75；dNTP 的工作浓度为100-300M ，最佳 Mg2+ 浓度为 2-3mM，最佳 pH 为 8.1-9.1；供应浓度为2.5-5U/l；-20保存至少一年。九、 Pfu DNA 聚合酶的使用方法：Pfu 酶的使用方法基本同Taq 酶。 DNA 扩增（ PCR）时， 50l标准反应体系需2.5U 左右。十、注意事项： (1) Pfu 酶扩增效率通常比Taq 酶差，这是由于Pfu 酶具有 3 5的外切酶活性（高保真性）所引起的，不是由于Pfu 酶的质量不稳定所致。 Pfu 酶在扩增 kb 以下的 DNA 片段和 Taq 没有多大差别。(2) 10 Pfu PCR Buffer 中已含有Mg2+ ，该缓冲液能保证扩增产物的保真性。提高反应体系的pH 和 Mg2+浓度能部分提高DNA 扩增的产率，但产物的保真性将有所下降。不提倡用Taq PCR反应缓冲液代替Pfu 酶缓冲液进行高保真扩增。(3) 用 Pfu 酶扩增时，引物的纯度要求较高，长度要求大于18 base，Tm 在 55-80之间。引物的浓度在0.1-0.5 M 之间，比Taq酶略高。 Pfu 酶具有 3 5 的外切酶活性可能会降解引物，特别是溶液中没有dNTP 的情况下。所以，Pfu 酶必须最后加入到反应体系中，并立即进行PCR 反应。(4) Pfu 酶的热稳定性比Taq 酶高，对于 GC 含量很高的模板，变性温度可以提高到98，不会影响 Pfu 酶的活性。(5) PCR 产物为平端， 不能直接用T/A 克隆方式克隆。 可选用其它相关产品克隆Pfu 酶扩增的 PCR 产物。 BCIP/NBT & BCIP/INT BCIP/NBT 可与碱性磷酸酶反应生成深蓝色不溶性氮兰四唑formazan 终产物。进行 DNA 印迹实验时， 是偶联到链酶亲和素、抗地高辛抗体或其它二抗上的碱性磷酸酶的反应底物。当组织要用苏木精对比染色时，与蓝色苏木精背景相对比，BCIP/INT 与碱性磷酸酶反应生成的砖红色终产物清晰可见，可避免了在同样情况下观察氮兰四唑formazan 时可能产生的误导结果。这两种底物具有性能稳定、敏感度高、使用方便等优点，与碱性磷酸酶反应后在浅色的背景下生成色彩鲜亮的不溶性产物，是进行印迹和杂交实验时的理想底物。HistoChoice MB HistoChoice MB作为一种分子生物学固定剂，具有安全无毒的优点。它不含甲醛、戊二醛或汞，完全无味，可通过排水管道进行排放处理。该种组织固定剂是专为分子生物学应用而设计，其设计独特的分子结构可以保护抗原决定簇或核酸位点。HistoChoice MB 替代了醛基、醇基、Zenders、B-5、 B-3、 Bouin 及其他固定剂。采用HistoChoice MB 固定的组织染色后可充分显示组织内部结构特点，可观察到细胞核和细胞质的更细微情况。甚至在长时间固定后仍能保持新鲜组织的外部形象。由于其分子结构是专门为分子生物学应用设计的，被HistoChoice MB固定的组织部位无需使用预消化或其它复原手段去获得重要位点。HistoChoice MB可使抗原或核酸保持它们的状态并与特定的抗体或探针结合。由于被保护的抗原决定簇的数量增加，原使用量的抗体通常可被稀释数倍后使用，降低了单个切片的处理费用。HistoChoice MB 固定的组织更软，保留了更多的自然形态。与福尔马林固定的硬化组织相比，较软的组织可以被切得更薄，切面更光滑。定色时间：细胞，15 20 分钟；组织切片，45 分钟；组织块 (1cm3)，2-3 小时。 HistoChoice Clearing Agent 二甲苯的替代物，不燃，并有以下特征:安全性无味、无毒、不致癌、不可燃烧；局部使用方便，不刺激皮肤；可按汽油的衍生物的常规处理方法来处理废弃的试剂。 性能与有机封固剂互溶； 溶化蜡比二甲苯快， 挥发慢；在自动操作程序中与异丙醇共同使用发挥作用；浸在 HistoChoice Clearing Agent 中，粘贴纸片易于除掉。经济费用与使用二甲苯以及甲苯差不多；可采用蒸发回流的方法回收反复使用。名师资料总结 - 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