2022年2022年酵母单杂交实验步骤总结 .pdf

. . 1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（ pBait-AbAi ）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到 pAbAi 载体 AbAir报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的 DNA三个以上的首尾连接的拷贝。 首尾连接的拷贝产生方式很多， 但对于长度小于 20 bp 的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。（1） 设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi 载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性） 。（2） 用 TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 mol/L 。（3） 将正向链和反向链按照1:1 的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为 50 mol/L ） 。（4） 95 C保温 30 s ，去除二级结构。（5） 72 C保温 2 min ，37 C保温 2 min ，25 C保温 2min。注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。（6） 冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 C冰箱备用。（7） 酶切 1 L pAbAi 载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。（8） 将退火后的寡核苷酸稀释100 倍至终浓度为 0.5 mol/L 。（9） 在连接反应管中加入如下成分：pAbAi 载体（ 50 ng/L） 1.0 L annealed oligonucleotide （0.5 mol/L ） 1.0 L 10T4 DNA ligase buffer 1.5 L BSA （10 mg/mL） 0.5 L Nuclease-free H2O 10.5 L T4 DNA ligase （400 U/L） 0.5 L 总体积 15 L 注：如果有必要，可用1 L nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。（10） 将反应体系室温放置连接3 h ，转化E coli，采用常规方法检测阳性克名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 13 页 - - - - - - - - - . . 隆。注：可用酶切或测序进行检测。2 质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter酵母菌株（图）图 3 Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意图（1） 用 BstB I或者 Bbs I 酶切 2 L pBait-AbAi，pMutant-AbAi ，p53-AbAi质粒，使其在 URA3 基因处断开，纯化酶切产物。（2） 按 Matchmaker Yeast Transformation System 2的步骤用 1 l 酶切后的质粒转化 Y1HGold酵母。（3） 稀释每个转化体系至1/10 、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura 琼脂平板上。3 d 后挑取 5 个单克隆，用 Matchmaker Insert Check PCR Mix1进行 PCR 检测阳性克隆，用Y1HGold的单克隆做阴性对照。（4） 在 PCR 管中加 25 l PCR-grade H2O 。（5） 用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。 将枪头伸进 PCR-grade H2O中搅拌，使酵母细胞散开。注：切忌挑取整个酵母单克隆， 因为细胞过多会阻止PCR反应的进行。 如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 13 页 - - - - - - - - - . . （6） 向每个管中加入 25 l Matchmaker Insert Check PCR Mix ，混匀，离心。每个 PCR管中现已含有如下反应物：Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 l H2O/yeast 25 l 总体积 50 l （7） 按下述程序进行 PCR 反应；95 C 1 min 98 C 10 s 55 C 30 s 30 cycles 68 C 2 min （8） 取 5 l PCR 产物，用 1% 的琼脂糖凝胶电泳分析。注：引物与 AbA基因以及 URA3 下游的 Y1HGold基因组结合，扩增片段长约1.4 kb 。图 4 PCR检测 pBait-AbAi的插入情况正确的 PCR 检测结果应是：阳性对照： 1.4 kb 阴性对照：无条带诱饵菌株： 1.35 kb+insert size （9） 分别挑取 PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi 对照克隆，在 SD/-Ura平板上划线培养。 30 C孵育 3 d 后，将平板置于 4 C保存，即为新构建的 Y1HGoldBait/AbAi菌株和 p53/AbAi 对照菌株。（10） 经过长期放置后， 挑取单克隆在 YPDA 液体培养基中过夜培养， 离心收集菌体，用 1 mL 预冷培养基（ 100 ml 灭菌的 YPDA 与 50 ml 灭菌的 75% 甘油混合）重悬菌体，速冻后与-70 C保存。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 13 页 - - - - - - - - - . . 3 检测诱饵菌株 AbAr基因的表达在不存在捕获物的情况下， 由于克隆到 pAbAi 载体中的诱饵序列不同， 诱饵菌 株 报 告 基 因 的 本 底 表 达 水 平也 不 相 同。 例 如 ： p53-AbAi对 照 的 最 低aureobasidin A抑制浓度为 100 ng/ml 。注： 酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。因此在进行文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株AbAr基因的表达情况十分重要。 所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的AbA浓度。（1） 分别挑取诱饵克隆和对照克隆， 用 0.9% NaCl重悬细胞，调节 A600到 0.002（大约 2000 个细胞 /100 l ） 。（2） 在下述培养基上分别涂布100 l 重悬后的菌液， 30 C培养 2-3 d 。SD/-Ura SD/-Ura with AbA （100 ng/mL）SD/-Ura with AbA （150 ng/mL）SD/-Ura with AbA （200 ng/mL）预期结果如下所示：表 1 AbAr基因预期本底表达结果AbA/ （ng/mL）Y1HGoldp53-AbAi 克隆数Y1HGoldpBait-AbAi克隆数0 约 2000 约 2000 100 0 Bait dependent 150 0 Bait dependent 200 0 Bait dependent （3） 在进行文库筛选时， 使用 AbA的浓度应为最低抑制浓度， 或使用比最低抑制浓度稍高的 AbA浓度（高约 50-100 ng/mL） ，以彻底抑制诱饵菌株的生长。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 13 页 - - - - - - - - - . . 注：如果200 ng/mL AbA 不能抑制本底表达，可以尝试提高AbA 浓度至500-1000 ng/mL 。然而，在不存在捕获物的情况下，如果1000 ng/mL 的 AbA浓度仍无法抑制AbAr基因的表达，那么很可能存在能够识别并与目的序列结合的内源调控因子，因而该目的序列无法用来进行酵母单杂交筛选。4 文库 cDNA的合成提取试材总 RNA ， 进行反转录合成 cDNA 。 合成的 cDNA 末端具有与 pGADT7-Rec相同的酶切位点。（1） cDNA第一链的合成准备高质量的 poly A 和/ 或总 RNA ，用 human placenta poly A+RNA 作为阳性对照。注：RNA 的质量决定文库的质量， RNA应为所要研究的特定时期和特定组织的 RNA 。在微量离心管中加入如下反应物： RNA 模板（0.025-1.0 g poly A和/ 或 0.10-2.0 g 总 RNA ） 1-2 l CDS III （oligo-dT ）or CDS III/6（random）引物 1.0 l Deionized H2O （使总体积达到 4.0 l ） 1-2 l 总体积 4.0 l 在另外一支管中加入对照cDNA反应物，即 RNA 使用 1 l（1 g）control poly A+RNA 。72 C孵育 2 min 。冰上放置 2 min ，轻轻混匀，立即加入步骤中的试剂。每一个反应加入如下试剂，轻轻混匀离心。 5 first-strand buffer 2.0 l 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 13 页 - - - - - - - - - . . DTT （100 mmol/L） 1.0 l dNTP mixture（10 mmol/L） 1.0 l SMART M-MLV RT 1.0 l 总体积 5.0 l 注：步骤中的试剂可在步骤之前加好置于冰上。此步是cDNA合成的起始关键步骤，变性后的RNA/ 引物 mix 冰上放置的时间不应超过2 min 。如果用的是 CDS III/6随机引物， 25-30 C保温 10 min。如果用的是 CDS III引物，省略此步，进行步骤。42 C保温 10 min 。加入 1 l SMART III oligo，充分混合， 42 C保温 1 h 。75 C保温 10 min 终止第一链的合成。降至室温，加入1 l RNase H （2 U） 。11 37 C保温 20 min 。12 cDNA第一链合成产物应于 -20 C保存，可用 3 个月。（2）long distance PCR （LD-PCR ）合成 cDNA 第二链根据合成 cDNA第一链时使用的 RNA 量， 下表给出了进行 LD-PCR 时最佳的热循环数。使用的热循环数越少，非特异性PCR产物越少。表 2 RNA量与最佳热循环数总 RNA/ g Poly A+RNA/ g 循环数1.0-2.0 0.5-1.0 15-20 0.5-1.0 0.25-0.5 20-22 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 13 页 - - - - - - - - - . . 0.25-0.5 0.125-0.25 22-24 0.05-0.25 0.025-0.125 24-26 LD-PCR 反应混合物中加入如下物质（每个样品做2 个 100 l 体系，对照做 1个 100 l 体系） ：First-strand cDNA （from protocol A） 2 l Deionized H2O 70 l 10advantage 2 PCR buffer 10 l 50dNTP mix 2 l 5 RACE 引物 2 l 3 RACE 引物 2 l Melting solution 10 l 50advantage 2 polymerase mix 2 l 总体积 100 l 按照以下程序进行PCR反应： 1个循环 95 C 30 s X个循环 95 C 10 s 68 C 6 min 1个循环 68 C 5 min 取 7 l PCR 产物用 1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用1 kb DNA ladder 。（2） 使用 CHROMA SPIN+TE-400柱纯化 ds cDNA 为每一个要纯化的cDNA样品准备一个 CHROMA SPIN+TE-400柱。将纯化柱翻转几次，充分悬浮gel matrix。移去柱的顶盖和底盖，将柱放入2 ml 收集管中。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 13 页 - - - - - - - - - . . 将柱放入离心机， 700 g 离心 5 min 以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。将柱放入新的收集管中，把cDNA 加到 gel matrix 的中央，切勿使样品沿柱的内壁流下。注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有小片段cDNA 。700 g 离心 5 min ，纯化的 cDNA收集到管中。将两个纯化的 cDNA样品合并到一管，测量体积。加入 1/10 体积 3 mol/L 醋酸钠（ pH5.3） ，混匀。加入 2.5 倍体积无水乙醇。-20 C冰冻 1 h 。室温， 14000 r/min离心 20 min 。小心弃去上清液，切勿碰到沉淀。14000 r/min瞬时离心，去除残留上清液。沉淀于空气中干燥10 min 。注：一般干燥至无乙醇味，不可过度干燥，否则很难溶解。用 20 l 灭菌去离子水溶解沉淀，此cDNA可用来进行同源重组构建文库。纯化后的 cDNA用 1% 的琼脂糖电泳检测。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 13 页 - - - - - - - - - . . 5 构建并筛选酵母单杂交文库（cDNA 融合表达文库的构建及筛选）（1） 构建并在 SD/-Leu/AbA 培养基上检测 Y1HGoldBait/AbAi菌株。注：AbA的浓度根据构建诱饵载体时转入酵母抑制本底表达时的浓度而定。（2） 按 SMART technology 步骤合成 ds cDNA，其浓度为 2-5 g/20 L。（3） 用 Yeast Transformation System 2 的方法转化酵母，在转化体系中加入如下物质：cDNA 文库转化 Y1HGoldBait/AbAi菌株 20 l SMART-amplified ds cDNA （2-5 g） 6 l pGADT7-Rec， （Sma I-linearized） （3 g）Y1HGold 53/AbAi 的转化 5 l p53 fragment （125 g） 2 l pGADT7-Rec， （SmaI-linearized） （1 g）将转化体系分别稀释至1/10、1/100、1/1000、1/10000 后，各取100 l涂 100 mm平板。文库转化涂SD/-Leu 和 SD/-Leu/AbA 平板，对照p53 转化涂 SD/-Leu 和SD/-Leu/AbA200平板。（4） 将剩余的所有文库转化混合物（约15 ml ）涂在 150 mm SD/-Leu/AbA 平板上，每板涂 150 l 。（5） 倒置培养 3-5 d 。（6） 3-5 d后，通过统计SD/-Leu 100 mm 平板上的克隆数目来计算筛选的克隆数。注：所筛选的克隆数至少应该达到1 百万，否则会降低筛选到目的产物的可能性。筛 选 的 克 隆 数 =cfu/ml on SD/-Leu dilution factorresuspension volume（15ml） 例如： resuspension volume=15 ml Plating volume=100 l 250 colonies grew on the 1/100 dilution on SD/-Leu plates 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 13 页 - - - - - - - - - . . The number of clones screened=250 cfu/0.1 ml10015 ml=3.75 million （7） 预期结果阳性对照试验： SD/-Leu 和 SD/-Leu/AbA200培养基上的克隆数相近。文库筛选试验： 根据 SD/-Leu 平板上的克隆数计算所筛选的克隆数，其结果应大于 1 百万且 SD/-Leu/AbA 平板上的克隆数远远少于1 百万，阳性克隆数目取决于诱饵序列。6 阳性克隆的鉴定及 cDNA质粒的分离（1） 阳性克隆重新划线培养，进行表型确认将阳性克隆在 SD/-Leu/AbA 培养基上重新划线，产生新的单克隆。2-4 d 后，选择能够正常生长的克隆进行后续分析。（2） 酵母克隆 PCR 消除重复克隆用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 （Cat.No.630497 ）进行 PCR ，对插入到 pGADT7 载体中的 cDNA片段进行扩增。 PCR 管中加入以下反应物： Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 l H2O/Yeast 25 l 总体积 50 l 按下述程序进行PCR 反应：94 C 1 min 98 C 10 s 68 C 3 min PCR 产物在 1% 的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。 产物不是单一的条带很正常， 这表明在同一酵母细胞不存在一种捕获载体名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 13 页 - - - - - - - - - . . 注：为了确认大小相近的条带是否是同一种插入片段，用Alu I或 Hae III或者其它常用的限制性内切酶消化PCR产物，产物用2% 的琼脂糖凝胶进行电泳分析。如果大量的克隆含有同一插入片段，则另取50 个克隆进行 PCR分析。为了快速验证克隆， PCR 产物可经过纯化后用T7引物测序。（3） 阳性 cDNA质粒的分离获取酵母中文库质粒的分开。与转化的大肠杆菌不同，转化的酵母细胞可以含多种相关质粒，这就意味着阳性克隆里不只含有能激活AbAr报告基因的质粒，还可能含有一种或多种不表达相互作用蛋白的cDNA质粒。如果不事先将非互作质粒分开出去而直接通过转化大肠杆菌获取质粒， 那么很有可能获取到非相互作用的质粒。为了增加获取阳性克隆捕获质粒的几率， 可以将阳性克隆在SD/-Leu/AbA 培养基上重复涂布2-3次，每次都挑取单一的克隆进行下一步涂布。从酵母中获取阳性cDNA质粒为了鉴定阳性互作相关的基因，用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit （Cat.No.630467 ）从酵母中获取阳性质粒。转化 E coli并分离阳性 cDNA质粒用常用的克隆菌株对阳性cDNA质粒进行克隆， 用 LB加 100 g/ml ampicillin进行选择。（4） 鉴别阳性和假阳性互作酵母单杂交筛选可能会检测到假阳性，用以下标准可以区分阳性和假阳性阳性：正确的诱饵序列和捕获物都是激活AbAr报告基因所必需的。假阳性：在诱饵序列突变的情况下，诱饵仍可以激活AbAr报告基因。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 13 页 - - - - - - - - - . . 用下述程序在选择培养基上对阳性和假阳性相互作用进行确认：用 Yeastmaker Transformation System 2的试剂和 small-scale转化程序将100 ng 获取的捕获质粒转化到Y1HGoldBait/AbAi和 Y1HGoldMutant/AbAi 菌株中。注：阳性对照和阴性对照实验应该一起进行。在 SD/-Leu 和 SD/-Leu/AbA 培养基上涂 100 l 转化混合物 1/10 和 1/100 的稀释物。30 C恒温培养 3-5 d 后，预期结果如表所示。表 3 阳性和假阳性相互作用验证结果A 阳性样品选择培养基2 mm清晰的克隆酵母菌SD/-Leu 有Y1HGold诱饵/AbAi+ 靶SD/-Leu/AbA 有酵母菌SD/-Leu 有名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 13 页 - - - - - - - - - . . Y1HGold突变/AbAi+ 靶SD/-Leu/AbA 无（或者很小）B 假阳性样品选择培养基2 mm清晰的克隆酵母菌SD/-Leu 有Y1HGold诱饵/AbAi+ 靶SD/-Leu/AbA 有酵母菌SD/-Leu 有Y1HGold突变/AbAi+ 靶SD/-Leu/AbA 有（5） 阳性克隆的测序分析一旦相互作用被验证为阳性，就可以测序鉴定捕获载体的插入cDNA片段，验证与 GAL4 AD序列融合的开放阅读框（ ORF ）序列，并与 GenBank 、EMBL 或其他数据库中的序列进行比较。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 13 页，共 13 页 - - - - - - - - -