细菌特殊耐药表型检测内酰胺酶的检测产内酰胺酶是导致细菌.docx

细菌特殊耐药表型检测一、 内酰胺酶检测产内酰胺酶是导致细菌对内酰胺类抗生素耐药主要原因，其中尤以超广谱内酰胺酶和染色体或质粒介导Ampc酶以及近年来出现碳青霉烯酶最为重要。1. 青霉素酶检测：显色头孢菌素法是目前临床实验室检测青霉素酶最常用方法之一。其原理是受试菌产生青霉素酶水解头孢硝噻吩分子结构中内酰胺环，产生由黄色向红色转变颜色反应，即为青霉素酶试验阳性。操作步骤：将受试菌直接涂布于经无菌水湿润后头孢硝噻吩纸片上，观察颜色反应，产生红色者为青霉素酶检测结果阳性。如下图所示 2超广 谱内酰胺酶（ESBLs）检测：ESBLs是一类在广谱酶TEM、SHV酶基因发生15个以上核苷酸点突变衍化而来系列酶，可同时水解青霉素类、头孢菌素类以及单环类氨曲南活性可被酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦或三唑巴坦所抑制。产ESBLs菌株主要见于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌。 目前，临床微生物实验室检测产ESBLs菌株方法主要有初筛试验、协同试验和酶抑制剂增强试验。（1）、初筛试验：初筛试验有纸片法和稀释法两种，这里以稀释法为例。按照常规稀释法接种受试菌。经35孵育1620h。结果判断：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌MIC：头孢泊肟4g/ml、头孢他啶1g/ml、氨曲南1g/ml、头孢噻肟1g/ml、头孢曲松1g/ml，任何一种药物达到上述标准，提示该菌株可能产ESBLs。奇异变形杆菌MIC：头孢泊肟1g/ml、头孢他啶1g/ml、头孢噻肟1g/ml，任何一种药物达到上述标准，提示该菌株可能产ESBLs。（使用一种以上药物进行筛选，将会提高检测敏感性）。（2）、双纸片协同试验：按常规纸片扩散法在MH 平板上涂布受试菌，平板中心贴阿莫西林/克拉维酸纸片。在该纸片周围，按纸片中心距25mm处分别贴上头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、头孢泊肟以及氨曲南等抗生素纸片。35培养1820h后阅读结果。任何一种纸片和阿莫西林/克拉维酸纸片质检产生“坑”或“匙扣”现象者，提示该菌株可能产ESBLs。（3）、酶抑制剂增强确证试验：确证试验有纸片法和稀释法两种，这里以稀释法为例。接种方法同初筛试验。经35孵育1620h。头孢他啶：0.25128g/ml；头孢他啶/克拉维酸：0.25/4128/4g/ml 和头孢噻肟：0.2564g/ml；头孢噻肟/克拉维酸0.25/464/4g/ml。和克拉维酸联合药物MIC相对单独药物MIC3个倍比稀释度，即判定该菌株产ESBLs。2010年1月，美国临床和实验室标准化研究所（CLSI）首次公布了修订头孢菌素(头孢唑林、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟和头孢曲松)和氨曲南解释标准（CLSI M100-S20）。并且头孢唑林解释标准于2010年6月被再次修订。当使用新修订解释标准时，在报告结果前不再需要常规测试ESBLs（即，不再需要将头孢菌素类、氨曲南或青霉素类结果从敏感修正为耐药）。然而，为了流行病学调查或者感染控制目，仍可测试ESBLs。3. 碳青霉烯酶检测：碳青霉烯酶是指能够水解碳青霉烯类抗菌药物如亚胺培南和美罗培南等一类内酰胺酶。2010年6月，美国临床和实验室标准化研究所（CLSI）修改了碳青霉烯类对肠杆菌药敏折点（CLSI M100-S20-U ），使用新折点后，碳青霉烯检测可以不作为常规药敏试验报告内容。然而，为了流行病学调查或者感染控制目，仍可检测碳青霉烯酶，碳青霉烯酶阳性结果不需要对药敏结果进行修改。这里主要介绍使用改良霍奇试验（MHT）方法检测碳青霉烯酶。操作步骤如下：接种物：使用肉汤或生理盐水制备0.5麦氏标准大肠埃希菌ATCC 25922菌悬液（指示菌），并做1:10稀释。按常规纸片扩散法程序，将菌液涂布在MH平板上，干燥310min.将10g厄他培南纸片或10g美罗培南纸片贴在平皿中心。接种：使用10l接种环或棉拭子，挑取35个在血平板上过夜培养受试菌，沿纸片边缘向平皿边缘划直线接种，接种长度至少达到2025mm。35孵育1620h。如下图所示：大肠埃希菌ATCC 25922大肠埃希菌ATCC 25922被厄他培南所抑制形成抑菌圈大肠埃希菌ATCC 25922增强生长。受试菌产生碳青霉烯酶，使扩散到培养基中厄他培南失活。因此，该处无足够量厄他培南抑制大肠埃希菌ATCC 25922生长，出现抑菌圈凹进现象。（1） 受试菌株，碳青霉烯酶阳性。（2） 受试菌株，碳青霉烯酶阴性。（3）受试菌株，碳青霉烯酶阳性。注意：（1）、某些试验菌株可产生抑制ATCC 25922生长物质。当出现此种情况时，在划线两侧可见清晰抑制生长区（如下图），对于这样菌株，MHT不能解释。 （2）还没有关于该项试验用于检测非发酵革兰阴性杆菌产碳青霉烯酶资料。二、 耐甲氧西林葡萄球菌检测耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）是医院感染主要致病菌之一。开展对MRS筛选，对于控制医院感染流行，减少多重耐药菌株产生和传播都有重要意义。MRS菌株表型检测方法主要有纸片扩散法、稀释法和苯唑西林盐平板筛选试验。这里主要介绍稀释法。金黄色葡萄球菌和路登葡萄球菌：按照常规稀释法接种受试菌， 35孵育1620h。苯唑西林MIC4g/ml；头孢西丁MIC8g/ml。苯唑西林和头孢西丁，两种药物中有任一结果达到上述标准，也即任一结果为耐药，则应报告受试菌株对苯唑西林耐药。除路登葡萄球菌外凝固酶阴性葡萄球菌：按照常规稀释法接种受试菌， 35孵育1620h。当苯唑西林MIC0.5g/ml，即应报告受试菌株对苯唑西林耐药。耐甲氧西林葡萄球菌，对所有青霉素类、-内酰胺/-内酰胺酶抑制剂复合物、头孢类（具有抗MRSA活性头孢菌素除外）和碳青霉烯类抗生素耐药。三、 万古霉素中介（VISA）和耐药（VRSA）金黄色葡萄球菌检测 测定所有葡萄球菌分离株对万古霉素敏感性应采用MIC试验。纸片扩散法既不能区分万古霉素敏感和中介金黄色葡萄球菌，也不能区分万古霉素敏感、中介和耐药凝固酶阴性葡萄球菌，任何万古霉素抑菌圈直径7mm葡萄球菌均不能报告该菌株对万古霉素敏感，必须通过万古霉素MIC测定进行确认。万古霉素琼脂稀释筛选法：接种物：将受试菌株制备成0.5麦氏浊度；接种：吸取10l菌悬液点种于含6g/ml万古霉素脑心浸液琼脂平板（BHI）上，或者用棉拭子蘸取菌悬液，挤去多余菌液，在平板上涂成直径1015mm斑点或者在部分区域划线接种；结果：经过35孵育24h，透射光下仔细观察细菌生长情况，1个菌落或存在淡膜状生长，提示该受试菌对万古霉素敏感性降低。注意：在此筛选平板上生长金黄色葡萄球菌，必须进一步采用稀释法测定万古霉素MIC值，以确认中介或耐药。四、 高水平氨基糖苷类耐药肠球菌（HLARE）检测高水平氨基糖苷类筛选试验，能够预测对于严重肠球菌感染（如心内膜炎）情况下，氨苄西林、青霉素或者万古霉素和一种氨基糖苷类类抗生素联合治疗时协同效应，除非证明受试菌株对庆大霉素或链霉素高水平耐药之外，上述药物联合对肠球菌可起到协同杀菌效果。因此测定对氨基糖苷类高剂量药物敏感性对临床治疗具有重要意义。检测方法：1、纸片扩散法：接种：按标准纸片扩散法操作，将0.5麦氏单位受试菌菌悬液均匀涂布于MH平板上，将 120g庆大霉素纸片或300g链霉素纸片贴于平板上；结果：经35孵育1618h后查看抑菌圈直径，6mm=耐药；79mm=不确定；10mm=敏感。2、肉汤微量稀释法：按照常规稀释法接种受试菌，35培养。庆大霉素,孵育24h，MIC500g/ml为耐药，500g/ml为敏感；链霉素，孵育2448h(假如在24h敏感，继续孵育)，MIC1000g/ml为耐药，1000g/ml为敏感3、标准解读：耐药和作用于细胞壁合成药物（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）联合无协同作用；不确定需要采用琼脂稀释法或肉汤稀释法进行确证；敏感和作用于细胞壁合成、而且也是敏感药物（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）联合出现协同作用。五、 万古霉素耐药肠球菌（VRE）检测由VRE所引起感染治疗十分棘手，而且还存在将万古霉素耐药性传到毒力更强细菌如金黄色葡萄球菌危险，因此临床实验室对VRE菌株检测具有非常重要意义。对VRE检测方法同对VISA和VRSA检测方法。六、 诱导克林霉素耐药检测 MLS群抗菌药物包括大环内酯类（如红霉素、阿奇霉素）、林可霉素类(如克林霉素)和链阳菌素类（如奎奴普丁/达福普丁），是三类功能密切相关但结构不同抗生素。葡萄球菌对大环内酯类耐药机制主要有两种，一是MS表型：对大环内酯类和B型链阳菌素耐药，但不耐克林霉素，即红霉素耐药而克林霉素敏感。二是B型链阳菌素固有表型：由erm基因决定。如果erm基因稳定表达，则表现对红霉素、克林霉素和其它MLS成员均耐药。但在某些情况下，erm基因需要诱导剂才能表达对克林霉素耐药，否则体外实验可能会表现为对克林霉素敏感，而红霉素可以作为这种诱导剂。克林霉素诱导耐药检测方法包括D试验法和肉汤微量稀释法。1、 D试验法按标准纸片扩散法进行操作，涂布0.5麦氏单位受试菌菌悬液于MH琼脂平板上，将红霉素（15g）和克林霉素（2g）纸片相邻放置，边缘相距1526mm。35孵育1618h后阅读结果，在靠近红霉素纸片一侧克林霉素抑菌圈出现截平现象（形状如大写D字），即为D试验阳性，提示该菌株诱导克林霉素耐药阳性。如果克林霉素抑菌圈不出现D形现象，则D试验为阴性。如下图所示：2、 肉汤微量稀释法按标准稀释法接种受试菌株，微量孔中药物终浓度为：红霉素4g/ml，克林霉素0.5g/ml。35孵育1824h后阅读结果。判断标准：微量孔中细菌生长即为D试验阳性，不生长即为D试验阴性。 段迎雪