大鼠肝纤维化模型制备.docx

大鼠肝纤维化模型制备中文摘要目的 本文通过对大鼠腹腔注射四氯化碳以诱导大鼠肝纤维化动物模型。方法 取15只大鼠，180220g，分为A组10只，B组5只，A组为模型组：404橄榄油混合液按0.12100g腹腔注射，一周两次，共八周。B组为对照组：纯橄榄油按0.12100g腹腔注射，一周两次，共八周，八周后，禁食12小时处死全部大鼠，解剖取肝组织。病理学检测：染色，染色染色。基因学检测：1.3.4型胶原蛋白结果 八周试验期间B组大鼠全部存活，肝组织标本结构清晰，无异常情况；A组大鼠出现明显的病态，肝组织标本均已达到肝纤维化S3以上，多数标本可见小叶被纤维结构分割包围，假小叶形成，干细胞可见脂肪变性；结论 该方法肝损伤明显，死亡率低，周期短，能够成功作为慢性肝损伤，肝纤维化的模型。关键词 肝纤维化，四氯化碳，动物模型: .: 15 ,180-220g, 10 A, B 5 只, A : 40% 4 0.12100g a , a , a . B : 0.12100g a , a , , 12 , . : , , . : 1.3.4 : B , , ; A S3 , , .: , , , . : , , 前言肝病包括1.慢性病毒性肝炎2.药物性肝炎 3.中毒性肝炎 4.脂肪肝 5.酒精肝 6.肝硬化 7.肝肿瘤 8.肝胆结石 9.肝囊肿 大多数肝病伴随着肝纤维化，肝纤维化是威胁人类健康的常见疾病，是各种慢性肝病最重要的病理特征，是发生肝硬化的病理基础，也是原发性肝癌发病的危险因素之一。肝损伤是各种肝脏疾病的病变结果，对肝损伤的防治目前仍是一个严峻的课题。通过建立实验性肝损伤动物模型，研究肝病的发生机制，筛选保肝药物，探索保肝作用原理，具有重要的现实意义。现将近年来国内外对实验性肝损伤动物模型分类、作用原理、造模方法及其优缺点等研究进展作综述和探讨。慢性肝病大多数都有肝纤维化，其中25%40% 最终发展成肝硬化乃至肝癌。我国是肝病大国，每年为肝病支出巨额的医药费，因此研究肝病的发生发展已成为医药科研工作者的迫切工作，建立高效，稳定的动物肝纤维化模型是进行研究的重要前提。科研过程中选择一个及人类疾病特征相似的动物模型是最为重要的, 它是科研工作能否成功以及有无科研价值最起码的基础之一。理想的肝纤维化模型病理改变呈阶段性，具有可逆及不可逆的阶段性演进过程，及人类疾病所致纤维化的形态特点一样，模型动物的表现符合中医“证” 的特征，且造模方法简单，模型形成率高，重现性好。因为肝纤维化的病因多样性、以及动物及人种属差异, 理想的肝纤维化动物模型的建立是临床研究和实验研究中的一个难点, 尚需进一步深入研究.迄今为止, 能完全反应人类肝纤维化的动物模型尚未完全取得成功。这就要求科研工作者充分了解各种类型模型的特点,在前人实验基础上积极探索,寻找理想的肝硬化动物模型, 并在具体工作中充分考虑肝纤维化形成过程中的病因和机制、人及动物的物种差异、造模动物的自然恢复率等多种因素, 选择最为合适的动物模型。肝纤维化表现为肝内细胞外间质成分过度异常地沉积，并影响肝脏的功能，是慢性肝病发展到肝硬化必经之阶段。现认为肝纤维化尚有逆转至正常的可能，而肝硬化则否。目前研究的重点放在分子及分子、分子及细胞及细胞及细胞间的相互作用方面阻断肝纤维化成为慢性肝病治疗中一个关键问题。建立肝纤维化动物模型是肝病研究中的一项重要课题。肝纤维化是肝损伤后的修复反应，涉及复杂的细胞及分子机制，是肝硬化的必经阶段。选择及人类相似的肝纤维化动物模型不仅是深入研究肝纤维化发病机制的重要基础，也是筛选防治肝纤维化药物的有效手段 。随着人们对肝纤维化的认识不断深入，有效的防治肝纤维化已成为可能。四氯化碳（4）是经典的诱发肝纤维化的一种肝毒性物质，法多用于研究肝纤维化发生机制、血清学标志物及组织病理的相关性及抗纤维化药物的筛选。四氯化碳(4)进入动物体内后，可直接进入肝细胞，经线粒体单加氧酶(P4502E1)系统代谢，代谢过程中产生三氯甲基和二氯甲基过氧化物。这些自由基启动脂质过氧化反应，使细胞及细胞器膜性结构严重破坏，造成肝细胞变性、坏死。长期给予4可造成肝纤维化、肝硬化。通过四氯化碳制备肝纤维化模型的途径有口服、腹腔注射、皮下注射。其形成肝纤维化的时间依据大鼠种系、给药途径、用药剂量的不同而有差别。文献综述如何制备及人类肝纤维化相似的动物模型，不仅是深入研究肝纤维化及肝硬化发病机制的重要基础。也是筛选防治药物的有效手段。本文重点讨论制备大鼠纤维化动物模型的不同研究方法及原理。并评述了4模型的优缺点及应用范围。不同造模方法制备的肝纤维化动物模型各具特点，选择最为合适的动物模型。肝纤维化研究是当今医学研究领域的热点难点之一,该病涉及到诸多复杂的致病因素及细胞功能和分子机制。研究表明，肝纤维化这个阶段是可逆转的，因此，阻断肝纤维化已成为目前肝病研究的热点之一。然而建立一个能反映人肝纤维化的动物模型一直是科学研究中的难点，建立一个能反映人肝纤维化的动物模型应该考虑到许多方面，构建一种稳定、可复制、便捷和仿真性强的肝硬化动物模型是研究的必要条件.一 化学性肝损伤模型 4毒性肝纤维化动物模型制备是一种经典的造模方法。4是一种选择性肝脏毒性物质，国外早在2O世纪3O年代即开始用4 作为实验性肝损伤的材料。高浓度的4 主要累及动物中枢神经系统，低浓度长期反复染毒则易损害肝、肾。4进入动物体内后，可直接进入肝细胞，使肝细胞变性、坏死，诱导肝纤维化的形成。造模途径多样、简便、病理特征稳定可靠 、造模时 间短 ，已广泛用于研究肝纤维化发生的细胞及分子机制、血清学标志物及组织病理的相关性及抗纤维化物质的药效评价。1. 四氯化碳法制备大鼠肝纤维化模型4油溶液按2m1体重剂量 ，予大鼠腹腔注射，每周2次，共8 周。宋健等2 采用 6O 1 橄榄油 溶液给雌 性 大 鼠以 0.13100g体重皮下注射，每周2次，共12周。该模型制作方法简单，肝纤维化病变过程可靠.2四氯化碳复合法制备大鼠肝纤维化模型孙敬方等3大鼠，用4O 5O 4油溶液按每百克体重 0.13 的剂量，给大鼠皮下注射，每周2次 。第2周开始隔日以2O 3O 乙醇 灌胃。饲料中混有 0.5 胆固醇低胆碱饲料，连续 8周。该模型可靠且复制时间短，肝纤维化进展稳定，适合于以引起肝细胞损伤为始动机制的肝硬化发生发展过程的动态研究。 甲基亚硝氨 ()诱导肝纤维化大鼠模型 二甲基亚硝氨具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性。大鼠染毒后致肝内小叶炎性细胞浸润，出血性坏死。在肝内形成中心 一 中心纤维间隔或中心一 门脉性纤维汪国运等用大鼠按10 体重的剂量，给予1 生理盐水稀释液，腹腔注射共10次。第 1周连续 3次，第 2、3、4周各1次， 第 6、7周各连续2次。刘成等以体积分数为0.05 浓度，剂量为 l0d体重腹 腔注射 大 鼠，每周连续3 次，共4周，第 1周用 23量，以后用全量。等给大鼠腹腔注射 每周3次，连续3周，第17天可见肝小叶坏死及嗜中性细胞浸润，21天可见胶原纤维沉积 ，胆管增生。本模型造模周期短，大鼠死亡率低 ，肝纤维化形成相对稳定。 吴丽等在评价药物对伴有凝血障碍，纤溶亢进的慢性肝病致纤维化的防治效果时，采用 肝纤维化模型尤为合适。另外该模型还用于研究不同细胞外基质的产生部位、评价肝纤维化血清标志物的可靠性等。四氯化碳(4)诱发的肝纤维化模型 4 是实验室最早使用诱发肝纤维化的毒剂.如曾给大鼠每周2次皮下注射0.1 4, 第六次注射后可见肝纤维化；注射21次后肝硬化已甚为明显，但停止注射后仍可痊愈；注射40次后肝纤维化即不可复原。此法造模时间长，动物的死亡率高。1969年 E用饮水中加入巴比妥，加四氯化碳蒸汽吸入法造摸。动物饮用两周后用4 蒸汽吸入，46周可形成肝纤维化，810周可形成肝硬化，死亡率仍在40%左右。国内学者王氏用4 溶于石蜡油中，经腹腔注射或皮下注射造摸，造摸时间可因注射途径和剂量的不同而不同，816周即可形成肝纤维化肝硬化模型，李氏在4 的基础上加用人血清蛋白诱发肝纤维化模型，此模型的成功率较一般造摸因素高，且更接近人类的肝纤维化一些。二 4诱导大鼠肝纤维化模型的建立肝纤维化是细胞外基质在肝内过度沉积的病理改变,多数慢性肝病人都有不同程度的肝纤维化,是多种慢性肝病的共同病理基础及特征,表现为以胶原为主的肝脏细胞外基质各成分合成增多,降解相对不足,过多沉积在肝内。若进一步发展引起肝小叶改建、假小叶及结节形成,其中25%40%最终发展成肝硬化乃至肝癌。因此,阻断肝纤维化就成为治疗慢性肝病中的一个关键问题4。肝纤维化动物模型的建立,是开展肝纤维化基础研究及实验治疗研究的重要手段,既可以深入研究其发病机理,又可以为临床筛选防治肝纤维化药物对肝纤维化进行早期诊断、早期治疗,可以预防肝硬化的发生、发展,能够提高肝病患者的生存时间和生命质量,具有重要的临床意义和价值。近年来,肝纤维化动物模型的研究多采用给实验动物施以不同性质、不同剂量及不同作用方式的肝毒剂,造成不同类型的肝纤维化模型,并取得了可喜的成就。主要有四氯化碳、血清制品、重金属、二甲基亚硝胺、硫代乙酰胺、胆总管套扎法、酒精及复合因素的建立模型方法5。4是诱导大鼠肝纤维化模型的最经典和广泛应用的肝毒性物质,该模型在肝纤维发生相关的组织学、生物化学、细胞和分子改变等方面具有最好的特性6。模型在形态学及病理生理学的某些方面及人的慢性肝病肝纤维化进展为肝硬化相似。4腹腔注射大鼠是经典的研究肝纤维化模型,具有简便、易行、价廉、耗时短和病变典型的优点,目前仍被广泛应用。本实验采用4模型复制方法,既可有效形成肝纤维化模型,同时橄榄油过多沉积造成脂肪堆积,及临床病人肝纤维化多伴有高脂饮食相接近,建模成功率高达80. 0%。活性增高提示肝细胞破坏,细胞膜通透性增强活性增高常提示线粒体损伤。两者是监测肝炎的敏感指标,当肝脏发生炎症、坏死时、就会从肝细胞内大量释放入血,导致血清中、升高。在本实验中随着造模时间的延长,肝损伤状态下,血中A 值倒置,提示肝功能继续损伤7。本组结果显示4第6周末模型组大鼠肝功能明显受损伤,血清活性明显升高,胶原纤维面积密度明显增加,汇管区大量纤维组织增生,较粗的纤维间隔伸入肝组织内,形成大小不等的假小叶。其中在第7周表现最明显。另外,通过尸检发现,建模失败死亡的大鼠腹腔内见弥漫性化脓性炎症,腹腔脏器表面附有脓苔,组织学观察见肝细胞广泛大面积坏死伴中性粒细胞浸润,死亡原因为严重感染。因此,实验过程中严格的无菌操作、防止感染是保证建模成功的重要因素。本实验成功地建立了大鼠肝纤维化模型,为后续的药物筛选实验做了铺垫,也为深入研究治疗肝纤维化的机理提供了动物模型。三 四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型改良的研究肝纤维化的本质是肝内细胞外基质( )的沉积增加和成分的改变,尤其是内胶原纤维的大量沉积2。已有的研究表明肝纤维化及一定程度的肝硬化是完全可以逆转的3,而肝纤维化模型的成功复制是开展其发病机制研究和实验性治疗的必要前提,目前已有的模型复制方法4-9包括使用酒精灌胃、胆总管阻断、硫代乙酰胺、二甲基亚硝胺及4染毒法,另外还可以使用异种血清或者蛋白注射引起免疫反应造成肝纤维化。有些学者10-11还采用复合方法进行肝纤维化的模型复制。而利用4复制肝纤维化模型是经典的制模方法,其在病理生理方面及人体肝纤维化的过程比较相似,同时具有制模方便、时间短、成模率高的特点,但是该法剂量难以掌握,实验动物死亡率较高,停止染毒后有自愈倾向。赖力英等12对不发现4给药剂量及肝脏损害呈正比,但每公斤体质量5 4则引起该组大鼠短期全部死亡,而每公斤体质量4 4灌胃可以建立大鼠急性肝功能衰竭动物模型。张海燕等13对4诱导慢性肝损伤的研究也有类似的结论,即浓度超过50%或给予剂量大于2.5·1以上时易导致动物急性中毒而死亡。由此可见探索及所需动物模型相合适的染毒剂量可以降低动物死亡率,提高实验效率。本研究对以往经典4造模方法进行调整,以小剂量4腹腔注射进行复制模型的尝试。按照经典方案按大鼠体质量404花生油溶液5 ·1腹腔注射,2次·周-1,并于普通全价饲料中添加10%猪油及2%胆固醇进行喂养,共8周,结果发现大鼠肝硬化同时出现严重的肝细胞脂肪变性,大鼠8周死亡率高达43.7%,而较多大鼠出现大量腹水则是肝硬化失代偿期的表现。本实验A组及B、C组相比较,各肝功能监测指标差异均有统计学意义(均P<0.05)。增高是肝细胞损害、细胞膜通透性增强的表现升高是肝细胞线粒体损伤的标志则是反映肝脏合成功能的重要指标之一。本实验中B、C 2组大鼠的、均较A组明显升高,而明显降低组肝脏功能又优于C组。说明4对大鼠肝功能的损害及染毒剂量有关。及染色显示组大鼠肝脏小叶结构紊乱,正常小叶被纤维分割,部分标本假小叶形成,多数已达到肝硬化早期组大鼠肝脏小叶内可见较多粗大纤维增生,肝细胞大量脂肪变性,其病理改变及该组大鼠出现大量腹水、肝功能严重损害的肝硬化失代偿期表现相符,此结果明显对于研究肝纤维化机制及抗肝纤维化药物的筛选实验不利。适当降低4剂量,并给予普通饲料饲养,结果显示大鼠死亡率下降(28.6%),而8周肝纤维化成模率不变(肝纤维化S2以上100%),成模后病理切片显示肝脏细胞少量脂肪变性,避免了4复制模型过度肝脂肪变性的弊端。本实验成功、高效地建立了肝纤维化模型,对经典4复制肝纤维化模型方法进行适当改良,降低了大鼠死亡率,提高了实验效率及肝纤维化模型质量。四 四氯化碳皮下注射制备肝纤维化模型的新设计肝硬化是我国常见病及重要死亡原因之一,肝纤维化系肝硬化早期。为开展相关研究,需要寻找一种快速、高效的制备肝纤维化动物模型的方法。本文以逐步提高四氯化碳的浓度、延长皮下注射时间的方法制备小鼠肝纤维化模型,通过检测血清透明质酸(,)的指标,探讨了一种建立肝纤维化模型的新方法。四氯化碳诱导慢性肝损伤的机理是直接损害肝细胞,破坏细胞的各种成份,具有耗时短和病变典型的优点,是使用最早、最广泛的肝纤维化诱导剂,用以制作经典的研究肝纤维化的模型。本实验对四氯化碳的浓度进行改进,先用20%四氯化碳诱导4周,使小鼠对诱导药物产生一个耐受过程,再提高四氯化碳的浓度,从而造成明显的肝脏损伤,并有纤维化形成。本文以昆明种小鼠为实验动物,具有实验费用低廉、易于操作、死亡率低、成功率高等优点。肝纤维化程度的准确判断是实验研究中最重要的问题。本文参照的肝纤维化分期标准,对肝纤维化的程度进行评价。肝星状细胞是正常肝脏合成血清透明质酸()的主要场所。四氯化碳可以激活肝星状细胞,使等细胞外基质合成增多,促使肝纤维化的形成和加重3,是反映肝活动性纤维化常用的定量指标。本文在3个月的造模观察过程中,实验组及对照组之间的差异有显著性,发现肝纤维化程度和含量逐渐递增,反映了肝纤维化的分期,说明本模型具有较明显的阶段性变化。综上所述,利用逐渐提高四氯化碳浓度经皮下注射法是一种较为理想的实验性肝纤维化模型制备方法,为研究肝纤维化打下了基础,可供临床和实验研究使用。 试验部分一 试剂和材料1实验动物及分组：大鼠15只，级，体重180220g，由牡丹江医学院医药研究中心动物房提供。自由饮水，以条状饲料喂养。正常饲养三天后分为两组：A组10只，B组5只2.试剂 伊红公司无水乙醇分析纯哈尔滨化工化学试剂厂苏木素公司四氯化碳沈阳市华东试剂厂硫酸铝钾天津市博迪化工股份有限公司二甲苯天津市富宇精细化工有限公司冰乙酸天津市博迪化工股份有限公司羧甲基纤维素钠天津市光复科技发展有限公司甲醇天津市博迪化工股份有限公司 伊红（醇溶液）的配制伊红：2.0g，95%酒精：400，将伊红溶解于95%酒精中，加入转子在电磁搅拌器上搅拌至完全溶解。 0.5%盐酸乙醇液三蒸水：300,95%乙醇：700，盐酸：5，分别倒入烧杯中混匀。 氏苏木素苏木素：2.5g，无水乙醇：25，硫酸铝钾：50g，蒸馏水：500，一氧化汞：1.25g，冰乙酸：20，先将苏木素溶于无水乙醇。取2000的三角烧瓶，倾入硫酸铝钾，加入蒸馏水，于电炉上加热，溶解硫酸铝钾，完全溶解后，待温度至90左右时，加入预先溶解好的乙醇苏木素，继续加热至沸腾，延续3，此时溶液逐渐加深，变为紫红色，去除热源，加入氧化汞，当充分氧化后，继续加热3，此时溶液变为深紫色，去除热源，直接将三角瓶插入冰水中，放于暗处，隔夜过滤加入冰乙酸。二 试验方法1大鼠腹腔注射一共15只大鼠分为两组，A组10只，B组5只，A组为模型组：按0.12100g腹腔注射404橄榄油混合液，一周两次，共八周。B组为对照组：纯橄榄油按0.12100g腹腔注射，一周两次，共八周。2.提取肝脏组织八周后，禁食12小时处死全部大鼠，解剖取肝组织。3.做肝组织石蜡切片3.1 取材 动物处死后先进行放血处理,组织块的取材厚 度一般为0.30.5,长和宽均不超过1。3.2 固定 10%甲醛固定12h24h,蒸馏水略洗即可脱 水。 3.3 脱水 脱水可用两种方法,即正丁醇脱水或梯度酒精脱水。3.3.1 正丁醇脱水:70%酒精,1h2h;80%酒精,1h2h;正丁醇(),1h2h;正丁醇(),1h2h;正丁醇(),1h3.3.2 梯度酒精脱水:70%酒精,1h2h;80%酒精,1h2h;90%酒精,0.5h1h;95% 酒精,0.5h;100%酒精,0.5h;100%酒精,0.5h。3.4 透明 二甲苯和,各1520。正丁醇脱水后不经此步直接浸蜡。3.5 浸蜡和包埋 浸蜡分三步,温箱的温度为60。蜡(熔 点4850 ),0.5h1h;蜡(熔点5254C),0.5h1h;蜡(熔点5658 ),0.51h。冬季易用熔点为5658石蜡包埋4.切片用旋转式切片机按操作规程操作，切片厚度5。5染色5.1 染色步骤染色流程100%二甲苯（）6100%二甲苯（）6100%乙醇（）5100%乙醇（）590%乙醇580%乙醇 570%乙醇 5蒸馏水 5 氏苏木素染液 4流水稍洗去0.5%盐酸乙醇液 3s蒸馏水稍洗20s0.5% 伊红（醇溶液）30s80%乙醇 30s90%乙醇 1100%乙醇 2100%二甲苯（）5100%二甲苯（）5中性树胶封片5.2 染色步骤染色流程100%二甲苯（）5100%二甲苯（）5100%乙醇（）5100%乙醇（）595%乙醇590%乙醇 585%乙醇 580%乙醇 5去离子水洗1波恩氏溶液染色，室温过夜流水洗片，至黄色消失格特氏苏木精溶液染色 5流水洗片 5去离子水漂洗猩红溶液染色2.5去离子水漂洗载玻片置入磷酸盐工作液中浸泡 5载玻片置入苯胺蓝溶液中浸泡50载玻片置入1醋酸溶液中浸泡2去离子水漂洗5.3 染色步骤染色流程100%二甲苯（）6100%二甲苯（）6100%乙醇（）5100%乙醇（）590%乙醇580%乙醇 570%乙醇 5蒸馏水 5入0.5%1%高碘酸氧化15流水稍洗去氏液( 氏液从冰箱取出升至室温使用)避光染色1030 ; 蒸馏水稍洗20s00.5%偏重亚硫酸钠(钾)浸洗2次，每次12 流水冲洗苏木精染2 5 自来水冲洗100%二甲苯（）5100%二甲苯（）5中性树胶封片61.3.4型胶原蛋白的检测三 实验结果两组大鼠均无死亡1. 肝组织切片的病理学检测结果比较染色比较，正常对照组肝细胞结构正常，无炎性细胞浸润，肝细胞多为单核，肝板呈条索状，围绕中央静脉呈放射状排列，无假小叶形成。模型组大鼠染色中肝组织炎症程度明显，可见大量肝细胞脂肪变性存在，呈空泡状，另有水样变性甚至气球样变，小叶间有大量炎症细胞浸润，正常肝小叶结构遭到破坏。染色比较正常对照组肝组织染色显示小叶间和汇管区基本无胶原纤维分布，仅在中央静脉及肝窦内有轻微的胶原纤维分布，小叶结构正常，其间未见有纤维结构增生。模型组在 染色下可见小叶间和汇管区有大量粗大增生的胶原纤维，肝小叶失去正常结构，被重新分割，组织切片中有大量假小叶形成，胶原纤维呈带状，互相连接。染色比较模型组和对照组相比肝细胞内和组织间有大量脂肪沉积，人肝纤维化一般伴随着脂肪的堆积，因此此模型更接近于人肝纤维化。2胶原蛋白含量比较比较对照组和模型组胶原1含量，模型组胶原蛋白1含量是对照组胶原蛋白1含量的5倍，比较对照组和模型组胶原3含量，模型组胶原蛋白3含量是对照组胶原蛋白3含量的3倍，比较对照组和模型组胶原4含量，模型组胶原蛋白4含量是对照组胶原蛋白4含量的3倍，说明在模型组中大量胶原蛋白沉积达到了肝纤维化。四讨论如何建立一种理想的肝纤维化动物模型,一直是实验研究的一个重点和难点。我们认为利用腹腔注射制备肝纤维化模型快速、高效、操作简便、病理结果可靠,是一种较为理想的实验性肝纤维化模型制备方法,值得在临床和实验研究中推广使用。肝纤维化的本质是肝内细胞外基质)的沉积增加和成分的改变,尤其是内胶原纤维的大量沉积121。已有的研究表明肝纤维化及一定程度的肝硬化是完全可以逆转的3,而肝纤维化模型的成功复制是开展其发病机制研究和实验性治疗的必要前提,目前已有的模型复制方法14一9咆括使用酒精灌胃、胆总管阻断、硫代乙酞胺、二甲基亚硝胺及四氯化碳染毒法,另外还可以使用异种血清或者蛋白注射引起免疫反应造成肝纤维化。而利用4复制肝纤维化模型是经典的制模方法,其在病理生理方面及人体肝纤维化的过程比较相似,同时具有制模方便、时间短、成模率高的特点,但是该法剂量难以掌握,实验动物死亡率较高,停止染毒后有自愈倾向。赖力英等12对不同剂量的4引起的大鼠肝脏损害进行对比研究,发现4给药剂量及肝脏损害呈正比,但每公斤体质量5 4则引起该组大鼠短期全部死亡,而每公斤体质量4 4灌胃可以建立大鼠急性肝功能衰竭动物模型。张海燕等13对4诱导慢性肝损伤的研究也有类似的结论,即浓度超过50%或给予剂量大于2.5 ·1以上时易导致动物急性中毒而死亡。，及染色显示: 对照组肝小叶结构正常,中央静脉旁有放射状排列的肝细胞窦,肝窦明显,肝细胞体积较大,核圆居中,可见核仁,胞浆丰富,汇管区清晰可辨,无明显炎细胞浸润。模型组肝血窦扩张充血,肝细胞颗粒变性明显,汇管区纤维组织增生,小血管扩张,部分区域内肝小叶结构破坏,纤维组织增生,有假小叶形成。符合文献中肝纤维化病理诊断标准。参考文献致 谢 感谢我的指导老师初彦辉教授在论文完成过程中给予我的悉心指导。 感谢牡丹江医学院医药研究中心其他老师们帮助及支持;特别感谢袁晓环老师和马鸿闯学长的对我的帮助2. 药物性肝炎 3.中毒性肝炎 4.脂肪肝 5.酒精肝 6.肝硬化 7.肝肿瘤 8.肝胆结石 9.肝囊肿 大多数肝病伴随着肝纤维化3. 2.药物性肝炎 3.中毒性肝炎 4.脂肪肝 5.酒精肝 6.肝硬化 7.肝肿瘤 8.肝胆结石 9.肝囊肿 大多数肝病伴随着肝纤维化二 药物性肝损伤模型    2.1  醋氨酚()  亦名对乙酰氨基酚、扑热息痛，经体内P450代谢可生成活性中间代谢物N乙酰对苯醌亚胺()，具强大的氧化作用，使生物膜系统发生脂质过氧化，干扰细胞内的能量代谢，导致肝细胞变性坏死，同时诱导肝组织细胞中高表达和穿孔素/颗粒酶，活化细胞死亡程序，导致肝细胞坏死14。引起肝障碍还及肝脏谷胱甘肽含量减少有关。加热下溶于生理盐水，给小鼠300500 一次性腹腔注射，也可配成质量浓度为2.5%的混悬液经口灌胃，制成急性肝损伤模型15。常用于制作急性肝功能衰竭模型，其诱导的急性肝功能衰竭模型及人急性肝功能衰竭的临床特点、组织学表现相似，是较理想的急性肝功能衰竭模型。肝损伤动物模型也可用于因各种原因导致谷胱甘肽含量减少而引起肝细胞损伤的治疗药物筛选。赵世锋等对杂种家犬采用多次皮下注射醋氨酚的方法建立急性肝损伤模型有以下特点：具有较好的重复性、可复制性和稳定性；有明显的肝脏损伤特异性对其他重要脏器无损害；对实验人员危害较小。3  免疫性肝损伤动物模型    3.1  卡介苗（ ，）加脂多糖（）  的损伤机制可能是小鼠注射后导致多核中性粒细胞或巨噬细胞(肝内库普弗细胞)聚集于肝脏并被致敏，继而用低剂量攻击，促进其释放大量对肝细胞有毒性作用的细胞因子，如白三烯、1和等，作为自由基，可以及O2反应生成超氧化亚硝酸阴离子()以及其他自由基引起脂质过氧化造成肝细胞损害。    等以浆液每只0.2 （含5×106菌）注射小鼠尾静脉，致敏后10 d，再尾静脉注射每只7.5 g，成功诱导小鼠肝损伤模型20。邱英锋等确定菌数5.0×107+ 剂量30 联合最佳，能够充分造成大鼠急性肝损伤21。和肝损伤动物模型简便易行，且造成的大鼠急性肝损伤及病毒性肝炎发病机制有较大相似，可用于对病毒性爆发性肝炎的研究。3.2  异种血清  异种血清诱导的免疫性肝纤维化其发生机制尚未明确。异种血清腹腔注射法，可选用猪、牛、羊等血清，其中以猪血清最为常用。猪血清每次0.5 腹腔注射或大鼠，每周2次，12周后肝内广泛纤维组织增生，假小叶形成，有典型肝硬化表现22。异种血清诱导的肝纤维化模型简便、经济、成功率高、病变单纯以及及人类病程相似，但有自愈倾向，造模周期较长，且牛和羊血清引起的动物死亡率较高2.2 其他  四环素（）导致肝损伤的机制仍未明确，禄保平等应用四环素10倍剂量（2 250 ），灌胃18 h成功制得急性肝损伤模型17。抗结核药物异烟肼具有肝毒性，禄保平等认为异烟肼的肝损伤机制及其代谢产物乙酰异烟肼和肼二者引起的自由基脂质过氧化反应有密切关系，应用2倍剂量（180 ）异烟肼灌胃后18 h，成功诱导急性肝损伤模型18，由于家兔对异烟肼敏感多选用家兔动物模型，异烟肼引起肝损伤动物模型多用于药物性肝炎的研究。4.25 / 25