中学生物实验植物细胞有丝分裂观察的改进与条件优化.docx

毕 业 论 文学生姓名吴 婷学 号191101029院 (系)生命科学学院专 业生物科学（师范）题 目中学生物实验“植物细胞有丝分裂观察”的改进与条件优化Improvements and Optimization of Condition for Observing Plant Cell Mitosis in Middle Normal School Biology Experiment指导教师 杨文杰 博士 （姓 名） （专业技术职称/学位） （姓 名） （专业技术职称/学位）2015年5月摘 要：植物根尖细胞有丝分裂实验是中学生物教学的一个基础实验，但是笔者在实习期间发现不同教材提供的实验方法存在一些异同，而且按照教材（人教版）中介绍的实验方法步骤去操作，成功率很低。本文结合生物学实验教学，通过改变解离液盐酸的使用浓度和解离时间、用希夫试剂代替龙胆紫或醋酸杨红溶液等技术，以大蒜根尖为试验材料，采用正交试验对实验方法进行优化，使有丝分裂实验的程序简化、时间缩短、成本降低、效果提高。其中，当解离液盐酸浓度为5mol/L，解离时间为5min，染色时间为5min时，根尖细胞有丝分裂的观察效果最好。关键词：有丝分裂，解离，染色，优化Abstract：The plant tip cell mitosis experiment is a basic experiment in middle normal school teaching. But I found that there are some similarities and differences between different teaching materials in the experimental methods. And if in accordance with the teaching material(PEP) experimental method step introduced to operate the experiment, the success rate is very low. In this paper, combined with biology experiment teaching. By changing the concentration of hydrochloric acid and the dissociation time, using Schiff's reagent instead of gentian violet or acetic acid magenta, taking the garlic root tip as experimental materials and optimizing the experimental methods with orthogonal experimental. It can simplify the programs, shorten the time, reduce the cost and raise the effect in this mitosis experiment. And when the concertration of hydrochloric is 5mol/L, the dissociation time is 5min and the dyeing time is 5min. We will get the best effect of the plant tip cell mitosis observed. Key words：mitosis, dissociate, dye, optimization目 录1 前言 41.1 中学实验教学中的细胞有丝分裂实验 41.2 细胞观察 42 材料与方法 62.1 材料、试剂与仪器 62.2 试验方法 63 结果与分析 8结论 10参考文献 11致谢 121 前言1.1 中学实验教学中的细胞有丝分裂实验观察植物细胞有丝分裂实验是新课程改革下高中阶段生物科学一个重要的实验。学生通过这一实验能够对植物染色体的构成情况以及细胞的分裂过程建立起初步的认识，并能够具备植物根尖制作以及有丝分裂装片的能力，进而自主完成有丝分裂生物图的绘制与处理。可以说，这一观察实验是整个高中阶段生物科学的基础性实验，做好实验能够为学生后续生物科学学习打下坚实的基础。1.2 细胞观察1.2.1 根尖解离方法1(1)浓盐酸解离法将根尖放入60水浴锅中预热的1mol/L盐酸，在60恒温条件下处理510min，当根尖的伸长区变透明而分生区呈米黄或乳白色时即可取出。若温度条件不允许，也可在常温中进行解离，适当提高解离液的浓度或延长解离时间。2012年刘怡通过比较人教版、浙教版、上海版三版教材，并对有丝分裂实验进行了优化，得出洋葱根尖在20%的盐酸解离液中解离5min效果最好2。(2)酶解法酶是专一高效的催化剂，纤维素酶可以催化纤维素分解，果胶酶可以催化细胞壁中的果胶分解。酶解法就是用酶类使该种酶的作用对象分解。将根尖放入2.5%纤维素酶和2.5%果胶酶的等量混合液中（pH5.0-5.5），室温下处理3h左右。2008年陈是宇等人在试验中省略了果胶酶的使用，分别用1mol/L盐酸在60下解离10min再用20g/L纤维素酶溶液在25下解离20min，不仅节省了时间和实验成本，同时能获得染色体铺展良好的效果3。酶解法，就是用生物酶去除一些结构。(3) 混合液处理法解离液中酒精的作用是迅速杀死细胞，固定细胞的分裂相；而盐酸能溶解果胶，从而使洋葱细胞的细胞壁软化，并使细胞间的中胶层物质溶解，从而达到分离细胞的目的。将根尖放入95%乙醇和浓盐酸1:1混合液中处理210min，或将根尖放入5mol/L盐酸中处理510min。有丝分裂观察实验中采用的最多的就是混合液处理法，2002年梁英豪在对洋葱根尖细胞有丝分裂实验的改进中得出将解离液改用30%盐酸:无水乙醇=1:1时，解离效果最好4。1.2.2 染色方法(1) 龙胆紫染色法 龙胆紫的稀溶液俗称紫药水，虽然在使用龙胆紫溶液染色时，溶液略显酸性，但因为其具有碱性基团，故其为一种碱性阳离子染色剂。在实验过程中我们常选用的染液试剂为0.01g/mL比例浓度的龙胆紫溶液。但在这种染液试剂配置下所进行的洋葱细胞有丝分裂实验中，学生普遍反应染液的浓度过高，整个洋葱根尖细胞在染液渗透下颜色偏深，不易分辨根尖部位，无法看清细胞内的染色体组成结构，细胞的分裂与再造过程进而也就无法全面的呈现在学生面前5。(2) 醋酸洋红染色法1921年，Belling首创了醋酸洋红压片法6。醋酸洋红中的醋酸是该染色剂的溶剂，醋酸增加了染色时细胞的通透性，利于洋红进入细胞核对染色体进行染色。在涂抹法与压碎法中，醋酸洋红常被用作核、染色体的固定和染色剂。实验中通常采用1%醋酸洋红：取100ml45%醋酸加热至沸，移去火源，徐徐加入1g洋红，加热回流224h，过滤（最好加几滴2%的铁明矾）7。2003年龙雯虹等人在对萝卜花粉粒染色的方法研究中论证了1%醋酸洋红的染色效果最好，文章中也较加热对染色效果的影响做了研究，结果表明不经加热处理的染色效果较好8。(3)孚尔根染色法1924年孚尔根首先用希夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。Schiff试剂又称品红醛试剂，与醛类反应呈紫红色。由于DNA分子结构中带有醛基-CH0，用HCI水解可使醛基释放，再以无色的亚硫酸品红液(Schiff)染色使醛基与亚硫酸品红结合，呈现紫红色，这是DNA特有的显色反应(即Feulgen反应)9。Schiff试剂有多种不同的配置方法，主要分为热配法10和冷配法11，本实验主要采用的是热配法：将0.5g碱性品红溶于100mL热蒸馏水中，使之充分溶解，待溶液冷却至50时过滤，再冷却到25时加入1 mol/L盐酸10ml和1g无水亚硫酸氢钠，放置暗处，静置24h后，加0.250.5g活性炭摇荡1min，过滤，溶液呈无色，装入棕色瓶中塞紧瓶塞，保存在冰箱内（04），用前预先取出，使之恢复至室温后再用。如溶液呈粉红色就不能用，须重配,一般配完2天之内使用12。植物细胞有丝分裂观察实验的方法有很多，不仅需要的条件不一样，得到的实验结果也不同。笔者在实习过程中发现，江苏地区普通高中使用的两种教材（人民教育出版社13、江苏教育出版社14）中实验方法不仅没有统一，而且过程比较复杂，如果在课堂实验教学中一成不变地按照教材的方式进行实验，植物细胞有丝分裂实验所取得的效果会不太明显，甚至存在失败的可能，实验观察的价值不够高，很难达到预期的教学效果。因而，如何在不断的实践探索中，立足于教材，高于教材，总结整理出能够正确获取实验反应结果的实验过程已成为当前相关教职员工最亟待解决的问题之一。本文就主要对实验中解离、染色等实验环节进行了改进和优化。2 材料与方法2.1 材料、试剂与仪器本研究已大蒜根尖为实验材料15，植物细胞有丝分裂实验一般都用洋葱做实验材料，可是在教学实践中发现效果不太好。培养洋葱根尖所需时间较长，发根较少且参差不一，由于学生实验必须按照课程表进行，而洋葱剪根又必须在根尖细胞分裂高峰期来剪取，而且大蒜易培养、易生根、根数目多、生长快、实验效果较好16，故改用大蒜。主要试剂为盐酸、希夫试剂、卡诺式固定液。主要仪器包括显微镜、载玻片、盖玻片、刀片等。并且没有在解离液中加入乙醇的原因，是采用希夫试剂染色法时发现乙醇对其染色效果有较大的影响，2004年王岚等人在实验中也发现了此问题17。2.2 试验方法2.2.1 大蒜根尖细胞玻片的制作1将大蒜瓣去皮，然后用竹签串起置于盛有清水的培养盒中，使根部与清水接触，在2025光照条件下培养34d。待根尖长到12cm时，选择健壮根尖，自尖端剪下后，放入卡诺氏固定液（3份无水乙醇、1份冰醋酸，现用现配）中固定保存。把经过解离、漂洗、染色后的根尖放在载玻片上，用刀片切去伸长区，只留12mm的分生区（也就是生长点）。加上盖玻片，在盖片上覆以吸水纸，用左手拇指盖住盖片的一角，用右手拿铅笔垂直敲盖片几下，用力要均匀，把材料震散。继续用左手拇指压住盖片一角，用右手拇指用力下压盖片，在保证两拨片不错动的前提下，将材料压成薄薄一层，即可放在显微镜下观察。2.2.2 预实验在预实验中，确定了盐酸浓度、解离时间和染色时间的范围。通过比较龙胆紫染色法和希夫试剂染色法，发现龙胆紫染色不易分辨根尖，而且在观察中发现染色体不明显，渗透性较差，染色效果不均匀。而希夫试剂只对细胞核和染色体着色，染色均匀一致，染色体与其背景形成的反差较大，易于观察细胞的有丝分裂，比较适合显微摄影，如图1、2所示。 图1 龙胆紫染色的根尖 图2 希夫试剂染色的根尖 2.2.3 正交试验设计采用L9（34）正交试验，对大蒜根尖进行处理，具体因素水平见表2。将解离液（盐酸）浓度（A）、解离时间（B）、染色时间（C）3个因素分别设置三个水平。表2 大蒜根尖有丝分裂实验的L9（34）正交试验的因素水平水平A：盐酸浓度(mol/L)B：解离时间(min)C：染色时间(min)133324553588表3 大蒜根尖有丝分裂实验的L9（34）正交试验表处理号ABC111121223133421352216232731283239331观察到的玻片效果以分数的形式记录，按100分制，解离效果占30%，染色效果占30%，总体效果占40%。3 结果与分析由正交试验结果表4看出，A因素极差最大，而且3个因素对实验观察效果的影响程度从大到小依次为A>C>B。说明解离液盐酸的浓度大小对实验观察的效果影响最大，而且最佳浓度是5mol/L，其次为染色时间和解离时间。表4 大蒜根尖有丝分裂实验的L9（34）正交试验的结果处理号ABC玻片效果111120212255313360421360522150623270731275832390933175k145.00051.66748.333k265.00065.00066.667k380.00068.33370.000R35.00016.66721.667由表4可知，A因素在不同水平之间差异达到了1%的极显著水平，B因素和C因素不同水平之间差异达到了5%显著水平。表4和表5表明，三个因素对实验效果均有显著影响，A因素的影响程度最大，B因素和C因素对实验效果的影响程度相当。其中，B因素B2水平与B3水平之间差异不显著，C因素C2水平与C3水平之间差异同样也不显著，因此，从提高课堂教学的效率考虑，B因素和C因素可以选择B2和C2。因此，最佳处理条件为A3B2C2，即解离液盐酸浓度为5mol/L，解离时间为5min，染色时间为5min，此时大蒜根尖细胞有丝分裂的观察效果最好。玻片效果如图3至图5所示，解离8min的细胞比解离5min的细胞更为分散，但是观察效果没有较大的区别，染色都比较均匀，分裂相的观察也很清楚。表5 大蒜根尖有丝分裂实验的L9（34）正交试验方差分析结果变异来源平方和自由度均方F值p值第1列3050215251830.005434783第2列516.66666672258.3333333310.03125第4列516.66666672258.3333333310.03125误差16.666728.33333总和4100图3 解离5min染色5min时10倍镜下玻片效果 图4 解离8min染色5min时20倍镜下玻片效果 图5 解离8min染色5min时10倍镜下玻片效果结 论Belling(1921)提出染色体压片技术后, 植物压片已成为植物染色体研究中广泛应用的常规技术18。通过植物细胞有丝分裂实验的学习，可以使学生观察到根尖细胞染色体变化及其特征，掌握压片制作技术，为学生以后进一步进行生物学其他实验和获取其他相关知识打下牢固的基础。对于学生来说，只从理论上讲解细胞的有丝分裂过程是远远不够的，必须亲手做实验，以增加感性认识。但是若一成不变地按照教材上的方法进行实验，实验效果不甚理想，学生很难清晰地观察到有丝分裂过程各时期染色体的行为变化，操作过程也繁琐。因此寻求一种简便快捷的实验方法，对于科学研究及教学都具有非常重要的作用。希夫试剂染色法自发明以来的60余年里，在世界范围内被公认为是最好的鉴定核酸DNA的细胞化学方法。2010年黄永莲采用了希夫试剂做为植物有丝分裂实验中的染色剂，并且证明选用希夫试剂作为染色剂最优19。所以本实验采纳了此方案，也对其进行了比较验证，最终决定用希夫试剂作为染色剂，而且对染色时间进行了优化，减少到5min。希夫试剂作为染色剂在很多实验中起了重要的作用，前人对希夫试剂的研究也有很多。除了本文中的配置方法，2004年刘康美，杨晓慧等人对希夫试剂配置方法进行了探讨20。预实验中发现，混合解离液中的乙醇会影响希夫试剂的染色效果，所以采用直接用盐酸解离的方法。一般解离液只用盐酸时会采用水浴锅加热的方法13,21，但是考虑到中学实验室条件的不允许，所以适当得增加了盐酸的浓度。通过正交试验表明，当盐酸浓度在5mol/L时，解离5min的效果最好，能够得到较为清晰的观察玻片。 经过创新优化后的实验，整个实验准备简单，操作方便，实验现象明显，收到了良好的实验效果。在植物细胞有丝分裂的实验中，若能坚持从本校的实际情况出发，认真研究、大胆探索、灵活改进，科学地优化组合，行之有效地借鉴他人的经验，经过多方探讨和实验，就能收到良好的实验效果。参考文献1 郭善利, 刘林德. 遗传学实验教程M. 北京: 科学出版社, 2010: 3.2 刘怡. 三版高中生物学教学中有丝分裂实验的比较及方案优化的探讨J. 中学生物学, 2012, 28(7): 42-44. 3 陈是宇, 方程. 燕麦属牧草根尖组织染色体观察方法的优化研究J. 草原与草坪, 2008, 2: 23-26. 4 梁英豪. 洋葱根尖细胞有丝分裂实验改进J. 洛阳师范学院学报, 2002, 2: 105-106. 5 姜丰仪. 观察植物细胞有丝分裂实验的几点发现J. 科技资讯, 2012, 5: 237. 6 李雅轩, 赵昕. 遗传学综合实验M. 北京: 科学出版社, 2006: 1. 7 刘绚霞. 醋酸洋红染色法测定油菜花粉的生活力J. 陕西农业科学, 1998, 1: 23-24. 8 龙雯虹, 许彬等. 醋酸洋红染色萝卜花粉粒的方法研究J. 高校实验室工作研究, 2003, 4: 49-50. 9 邢惠清, 田玉旺等. 介绍以甲基紫配成Schiff试剂显示DNA染色方法J. 中国组织化学与细胞化学, 1994(03): 308. 10 凌启波. 实用病理特殊染色和组化技术M. 广州: 广东高等教育出版社, 1989. 11 龚志锦, 詹洲. 病理组织制片和染色技术M. 上海: 上海科学技术出版社, 1994. 12 任丽丽. Schiff试剂配置方法的改进和体会J. 卫生职业教育, 2010, 28(19): 116. 13 朱正威, 赵占良等. 义务教育教科书生物学七年级上册M. 北京: 人民教育出版社, 2012. 14 匡廷云, 曹惠玲等. 义务教育教科书生物学七年级上册M. 南京: 江苏科学技术出版社, 2012. 15 赵培军. 用大蒜做植物细胞有丝分裂实验的材料更好J. 生物学通报, 2006, 3: 60. 16 宋瑛. 植物细胞有丝分裂实验材料和方法的改进J. 教学仪器与实验, 2010, 26(6): 29-30. 17 王岚, 姬可平等.希夫试剂(Schiff's reagent)显示DNA染色方法的改进J. 实验室研究与探索, 2004, 23(5): 49-50. 18 朱微. 植物染色体及染色体技术M. 北京: 科学出版社, 1982. 19 黄永莲. 植物细胞有丝分裂实验条件优化J. 北方园艺, 2010, 13: 129-132. 20 刘康美, 杨晓慧等. 希夫试剂配制方法的探讨J. 西安联合大学学报, 2004, 7(5): 50-52. 21 杨起简, 周禾等. 豌豆染色体制片技术的比较研究J. 北京农学院学报, 2003, 18(3): 172-173. 致 谢本论文是在导师杨文杰博士的悉心指导下完成的。杨老师渊博的专业知识、严谨的治学态度和精益求精的工作作风对我影响深远。从选题、制定方案、进行实验，到论文的格式和书写，每一步都是在老师的指导下完成的。特别是在正式实验开始之前，花了较多的时间与杨老师一起讨论实验方案的制定与预实验的开展。在此谨向指导老师杨文杰博士表示崇高的敬意和衷心的感谢。本论文的顺利完成，也离不开生科院实验室对学生的开放。生物研究离不开实验，学院给了我们学生一个很好的平台，让学生在老师的指导下进行一系列的实验探究，提高自身的能力素质，更好地培养我们的创新能力。