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自然功能性食品添加剂酪蛋白磷酸肽的讨论进摘要：酪蛋白磷酸肽(CPPs)是含有成簇的磷酸丝氨酸的生物活性肽，现已证 明，CPPs具有重要生理功能。本文就CPPs的结构、理化性质、制备工艺、检 测方法、生理功能及应用进行了系统的概述。关键词：酪蛋白磷酸肽；结构；制备；生理功能；应用引言酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphope Ptides, CPPs)是以牛奶酪蛋白为原料, 经过单一或复合蛋白酶的水解，再对水解产物分别纯化后得到的含有磷酸丝氨酸 簇的自然 生理活性肽口。CPPs能促进机体肠粘膜对钙、铁、锌和硒，尤其是 钙的汲取和采用，被誉为“矿物质载体"。CPPs是目前唯一促进钙汲取的活性肽, 同时在提高机体免疫力、改善繁殖性能等方面也有重要作用。日本、德国等我国 已把CPPs定为功能性食品，与CPPs相关的讨论越来越受到我们我国科学家和食 品工作者的广泛关注。1 CPPs的结构牛乳酪蛋白的主要成分为a si、as2、B和k-酪蛋白，除k 一酪蛋白外， a和B 一酪蛋白都具有成簇存在的磷酸丝氨酸残基(Ser P)。酪蛋白经体外酶 水解后，产生CPPs, CPPs的核心部位是由3个磷酸丝氨酸残基组成的一个一 Ser (P) 一残基簇，后面紧接着2个一 Glu 一残基，即一 serP 一 SerP - SerP 一 Glu 一 Glu 一，现已证明这个结构是发挥其生物活性必不行少的。Hiroshil等1974年用动物试验说明，酪蛋白可在动物体内形成CPPs,并确 定其结构为 serP serP-SerP Glu He Pro Asno 1996 年 Nieholasf 习等用胰蛋白酶水解酪蛋白，得到包含有一 SerP 一 SerP - SerP-Glu 一 Glu 一 序列的CPPs,从而得知了 CPPs实际上是一类含有磷酸丝氨酸和谷氨酸的短肽， 其产品分子量不均一 2。2 CPPs的理化性质溶解性CPPs产品具有良好的溶解性，其pH值为2. 010.0,其溶解性除 在pH值4.0约为90%外，其他均高于90%,且溶解性随pH值的增高而增大。2.1 起泡性CPPs产品较酪蛋白具有更好的起泡性和泡沫稳定性。2.2 乳化力CPPs产品乳化力较好。但与酪蛋白相比有所下降。同时，CPPs产 品的乳化性和乳化稳定性与酪蛋白相比，分别下降了 2. 89%和1. 45倍。2.3 热稳定性 在CPPs产品加工时可以进行有效的杀菌处理，在100 C 30 min条件下杀菌不会使产品外观转变。CPPs作为钙、铁汲取促进剂，Ca?+的存在 不会影响产品的色泽3。3 CPPs的制备工艺在Hannu等4的一项讨论中总结了制备生物活性肽（包括CPPs）的途径 主要有以下3种：一是在体内通过消化酶的水解，二是用有蛋白水解性的微生 物发酵剂进行发酵乳类，三是采用蛋白酶的水解。除了以上几种酶水解的方法外, 重组DNA技术也可以用来制得人类所需要的肽段或其前体，某讨论者于1999 年胜利地从Escherichia colt中表达重组了人类的a S1-酪蛋白，并分别纯化 了它。传统的工业生产CPPs 一般以酪蛋白或牛奶为原料，用蛋白酶水解，使 CPPs游离，用离子交换法或酶法脱除苦味成分，制备低纯度产品。高纯度产品 可采纳膜分别、离子交换法、反向高效液相色谱法等手段进行精制。近年来进展 起一种制备CPPs的方法是微生物发酵法，即直接采用微生物发酵过程中产生 的蛋白酶（复合）降解蛋白质，可到达较高的水解度，从而相对地降低酶法生产 活性肽的本钱5。目前一般采纳具专一性蛋白酶如胰蛋白酶，胃蛋白酶-胰蛋白酶，凝乳酶- 胰蛋白酶，碱性蛋白酶等水解酪蛋白制取CPPo CPP的分别方法有钙-乙醇沉淀 法、膜分别法、离子交换法等。常用的方法为钙-乙醇沉淀法,工艺流程见图1 6:福蛋白r醐消化|离心上清液沉淀沉淀WCa-乙醇）上清液cpp- in 1 r图1钙-乙酹沉淀法工艺流程4 CPPs的检测方法目前，CPPs的检测通常采纳反相高效液相色谱法（RP-HPLC法）或高效液 相毛细管区带电泳法（HPEC）进行分别，并结合末端氨基酸分析技术以确定各种 磷酸肽的一级结构。Le-mieux 7将分子筛色谱与反相HPLC联用，胜利分别 并鉴定多种CPPso通过铝蓝比色法等可测定CPPs中磷酸基团的含量。Miquel 等8采纳RP- HPLC- ESI- MS /MS第1次胜利地分别出12种CPPs。我们我国分别技术较为落后，庞广昌等9对直接定磷法，SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法，聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IFE）法进行比拟，这 3种方法均可对CPPs进行定量测定，分别适用于产量测定、组分测定和较精确 测定。2002年周杏琴等10用反相C18液相制备色谱柱，经过2次不同梯度 的洗脱，得到了 4种不同组分的CPPso这些方法都需要昂贵的仪器和药品，且 要求较高的操作技术，因此，CPPs检测方法的简化仍需要进一步讨论。5 CPPs的生理功能及作用机理促进肠道对矿物元素的汲取和采用早在20世纪40年月Mel lander等首次从酪蛋白的胰蛋白酶水解产物分别 到磷酸肽，并证明这些肽的钙盐在生理pH值下具有特别好的溶解性，无论正常 婴儿还是佝偻病患儿，对CPPs形式的钙比对自然条件下的钙都能更好地采用。 讨论觉察CPPs可增加钙的生物采用率，在缺乏维生素D状况下，患有佝偻病小 孩服用酪蛋白经胰蛋白酶消化的产物可强化骨骼钙化5。动物试验证明，CPPs 可在中性或偏碱性条件下阻挡钙的沉淀，从而促进钙在小肠中汲取。CPPs虽可抑制磷酸钙形成沉淀，却不能使已形成磷酸钙溶解,CPPs的结构, 特殊是其分子内亲水和疏水氨基酸的排布打算了它在磷酸钙晶体增长中是一个 重要的调整因子。此外CPPs还可促进铁、锦、锌、硒等汲取11。CPPs促进矿物质汲取的机制是：CPPs带有较多负电荷，既可以对抗消化道 中各种酶的水解，又可以通过Ser-P与Ca、Fe等离子螫合形成可溶物，从而 有效地防止溶解的金属离子在小肠中性或偏碱环境中与p（v 一结合形成磷酸盐 沉淀。同时，CPPs还可以有效地增加矿物质在体内的滞留时间，最终由于矿物 质离子浓度的提高而促进矿物质的被动汲取12。5. 2防脯齿，促进牙齿、骨骼中钙的沉积和钙化一般认为，酪蛋白磷酸肽促进钙沉积和骨骼、牙齿钙化的缘由是它在提高 钙汲取、采用的同时，削减了破骨细胞的作用，抑制了骨的再汲取13。牙釉质表层的脱矿和再矿化是一个动态变化的过程。讨论说明，酪蛋白磷酸 肽具有明显的抗蛀牙功能，可用于防止和治疗牙结石。酪蛋白磷酸肽在溶液中能 与钙磷结合成复合体，即酪蛋白磷酸肽钙磷复合体。它是可溶性复合物，附着在 龈齿损坏处，维持高水平的钙离子浓度，促使钙离子进入龈损区，促进早期龈损 再矿化，从而有效地防止牙蚀细菌的侵蚀，到达抗脯齿的作用14。Cross等15讨论证明早期牙釉质损伤的修复是源于酪蛋白磷酸肽（CPP） 与无定形磷酸钙（ACP）形成的稳定复合物。CPP形成磷酸钙运载工具，这阻挡 了牙釉质去矿化并促进了再矿化。Yamaguchi等16通过超声波脉冲在不破坏状况下测定牙釉质结构的去矿 化和再矿化，得出结论高浓度CPP-ACP中含有的无机成分可增加牙釉质的再矿 化。目前，用酪蛋白磷酸肽制成的抗龈齿添加剂是唯一不同于氟化物的添加剂。 5.3促进受精力量，提高繁殖性能关于CPP促进受精力量,提高繁殖性能的报道较少。Nagai等（1994）报道,CPP 能提高精子和卵细胞的受精率。他们觉察,含CPP培育液中的精子明显比其他组 具有更高的穿透卵细胞的力量,进一步试验觉察，这些精子对钙的汲取力量强于 比照组。此外,CPP还能削减精子的变异程度而使胚胎发育更加稳定。姜毓君等 （2004）讨论说明，重组B-CPP二聚体能使家兔精子细胞内的游离Ca2+浓度明显 上升（P0.01）,说明重组B- CPP二聚体和自然CPP一样,均可起到促进精子细 胞对Ca2+汲取的作用；而且与阴性比照组相比,重组B -CPP二聚体上升精子细胞 内的游离Ca2+浓度的作用较自然 蛋白更为明显（P<0.01对P<0. 05）。同时得出， 初步纯化的表达产物与阴性比照相比,对家兔精子细胞表现出差异极显著的促进 Ca2+汲取的作用，而精子细胞内Ca2+水平的提高将大大提高精子细胞的获能作 用，从而加强精子细胞穿透卵细胞的力量，利于精卵细胞结合，促进受精过程 17 o5. 4增加动物机体免疫力CPPs结构中起免疫调整作用的部位是含有3个氨基酸残基的小肽且N端和C 端分别是一个磷酸丝氨酸残基，即SerP-X-SerP结构。Ca?十是触发淋巴细胞增殖 反响的第一信号，Cd?*载体A23187对淋巴细胞增殖具有丝裂原作用。CPPs通过 SerP Ca?形成复合物阻挡磷酸钙沉淀的产生从而促进C/的汲取，到达促进动物 免疫机能的作用18。CPPs还通过调整淋巴细胞因子的水平来调整动物免疫功能。5 . 5细胞凋亡诱导作用Cpps促肿瘤细胞凋亡的作用已经在人肠上皮腺瘤细胞HT- 29细胞、Caco2 细胞、白血病细胞HL- 60以及神经胶质瘤细胞PC12等细胞模型中得到证明。 上述肿瘤细胞可以被B-Cpps触发凋亡。Cpps诱导了恶性肿瘤细胞凋亡却未对 非恶性细胞(如CH0细胞和脾细胞)起到同样的作用，提示其具有潜在的药理 学意义。因此，细胞凋亡诱导肽可能成为潜在的抗癌药物19。6 CPPs的应用1 CPPs在食品工业上的应用酪蛋白磷酸肽是作为汲取促进剂用于开发制造钙、铁功能食品的关键性原 料，也是迄今为止唯一胜利应用于功能性食品的生理活性肽。目前，在国外市场 上已有含酪蛋白磷酸肽的很多适用于儿童老人、孕妇等不同人群的各种保健食 品，诸如糖果、饮料、饼干、奶酪制品、甜点、畜肉制品、各种乳制品等。酪蛋 白磷酸肽在日本、澳大利亚、东南亚、欧洲等我国和地区已广泛应用于钙强化乳 制品、果汁饮料、蛋白饮料和速溶饮品、运动食品、糖果 养分素补充剂，以及 防龈齿的口香糖中20。6.2 Cpps在药物中的应用由于CPPs是从自然 蛋白中提取的多肽，具有致敏性小、无细胞毒性、 平安牢靠的优点，因此充分运用这些特点，可用于对佝偻病，牙科病和骨质疏松 症等疾病的治疗；制成抗蛀牙牙膏，漱口液或含片等，还制成可促进动物体外受 精和细胞融合的生化制剂等21 o3 CPPs在动物生产上的应用CPPs在动物生产上主要是作为一种功能性的饲料添加剂使用。添加到日粮 中促进动物对矿物质离子的汲取采用。Ashida等人(1996)试验说明，在低钙 日粮中添加0.5%-1.0%的CPPs可提高蛋鸡的蛋壳强度，降低破蛋率，增加机 体的体质，削减腿病的发生。在种猪日粮中添加CPPs能显著提高卵细胞的受精 率，提高种畜繁殖性能。对怀孕母畜及种用家畜，还可防止其他常量微量矿物元 素的缺乏。在仔猪日粮中添加CPPs可促进铁的汲取，防止养分性缺铁贫血，并 能显著提高仔猪血清中特异性IgA. IgM. IgG的含量，从而增加仔猪的免疫力 22 o7结束语随着生活水平的不断提高，人类钙养分素缺乏的问题日益受到广泛的关注。目前，国外已将CPPs应用于儿童咖喔饭、饮料、口香糖等食品和保健品中。 对儿童缺钙、老年人骨质疏松、不育症的治疗和牙齿保健方面的讨论和应用也 在进行之中。还有人讨论了酪蛋白、脱脂乳蛋白和CPPs的致敏反响，觉察 CPPs的致敏性很小，说明它能够适用于对牛奶过敏的体质。由于我们我国民众膳食组成以植物性食物为主，其中含有大量的影响钙、 铁、锌汲取因子，如植酸、草酸、纤维素等，没有大量消费乳制品的习惯，缺 钙尤为严峻。目前，我们我国从儿童到中老年人各年龄组的人群，普遍存在缺钙 问题。CPPs不仅可促进钙的汲取，对铁、锌的汲取采用也有良好的促进效果, 且CPPs来源于牛乳蛋白质，具有不良反响小、平安牢靠的优点，即使超量服 用也不会对人体产生任何毒副作用，这更使得CPPs在养分强化食品和保健食 品中的应用备受瞩目。因此开发添加CPPs的养分食品和保健品，能真正到达有 效补充人体缺乏的矿物质的目的，满意人们的养分需求23 o参考文献1段俊红，王之盛，周安国.酪蛋白磷酸肽(CPP)与钙、铁养分讨论进展 J.饲料工业，2007, 28(6) : 37-40.2张黎明，袁永俊，徐梦虬.酪蛋白磷酸肽的讨论进展J.生命科学仪 器，2022, 7(1) :38-41.3刘文，陈有亮,酪蛋白磷酸肽的功能及其制备J.科技通报，2022, 26(1) : 55-56.4 Korhonen H. Bioactivepeptides: Production and functionality J. IntDairy Jo, 2006, 16:945-960.5王青华，赵征.酪蛋白磷酸肽(CPPs)的开发趋势及应用前景J.食品 讨论与开发，2007, 28(5) : 146-149.6王光明，王春梅.酪蛋白磷酸肽的讨论及展望J.江西饲料，2007, (1) :8-9.7 Lemieux L. HPLC of casein hydrolysates phosphorylated and dephos-phorylted J. J Chromatogr, 1990, 519: 229 321.8 Miquel E. 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