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实验一：分光光度法一：定义：分光光度法是根据物质对不同波长的光波具有选择性吸收的特性-即可以产生吸收光谱，而建立起来的一种定量，定性分析的方法。分类：根据波长范围可分为紫外，可见和红外分光光度法。特点：1，与其它光谱分析方法相比，起仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快， 2，灵敏度高3，选择性好4，精密度和准确度较高 5，用途广泛。二：分光光度法基本原理：物质对光的选择性吸收1：光的基本性质：波动性，微粒性2：物质对光的选择性吸收：一种物质呈现何种颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。能复合成白光的两种颜色的光也称为互补色光。3：吸收曲线（光谱）物质的分子内部存在状态：电子能级，振动能级，转动能级组成：紫外-可见吸收光谱，红外吸收光谱，远红外吸收光谱4、透光率和吸光度 当一束单色光通过均匀的溶液时，入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则I0 = Ia + It + Ir 透光率(transmittance)T：透射光的强度It与入射光强度I0之比。 透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；透光率愈小，溶液对光的吸收愈多。吸光度A:透光率的负对数。A愈大，溶液对光的吸收愈多。 5、Lambert-Beer定律 Lambert定律：当一适当波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，其吸光度与光通过的液层厚度成正比。式中b为液层厚度，k1为比例系数，它与被测物质性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度及温度有关，Lambert定律对所有的均匀介质都是适用的。 三：分光光度计的基本组成(1)光源光源的作用：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯(3202500 nm)紫外区：氢灯，氘灯(180375 nm)(2) 单色器单色器的作用：从光源的连续光谱中，分出某一波长范围的光，作为吸光光度分析的光源。棱镜：玻璃3503200 nm，石英1854000 nm；光栅：波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便光栅工作原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。(3) 吸收池（比色皿）比色皿用于盛参比溶液和被测试液。一般为长方形。同样厚度比色皿之间的透光率相差应小于0.5%。玻璃 能吸收紫外光，仅适用于可见光区石英 不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区(4) 检测器:利用光电效应，将光能转换成电流讯号。常用的是：光电池，光电管，光电倍增管。(5)检流计:低档仪器：刻度显示；中高档仪器：数字显示，自动扫描记录。四：思考题1：为什么 物质对不同波长的光具有选择性吸收的特性？因为物质本身的分子，原子都处在一定能级的运动状态，当物质吸收了光的辐射以后，会产生能级跃迁，从而产生吸收光谱，由于光的波粒二象性，只有当入射光的能量同吸光物质的基态和激发态能量差相等时才会被吸收，而物质的基态和激发态是由物质的原子构成和原子间相互作用决定的，因此不同物质的能态不同，对光的选择性吸收也不一样2：分光光度法用于物质的定性分析和定量分析有那些区别定性分析是选择合适溶剂，在相同条件下测相近待测液与标准液的吸光光谱定量分析是选择适当空白液作为基准，分别测定其n组溶液的A。实验二：血清谷丙转氨酶（ALT)活性的测定（赖氏法）一、实验目的： 掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 掌握比色定量分析中的标准曲线法。 .熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。 了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。二、实验原理 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸. 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。 【临床意义】 肝细胞中含ALT最丰富， 因此当肝脏疾病致肝细胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清中ALT活性增高。 测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。 ALT显著增高见于：各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死， 中等程度增高见于：肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞， 轻度增高则见于：阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。 骨骼肌损伤、多发性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。I. 注意事项】1. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。 2. 在血清中加入底物后，应准确记时。六、思考题测定血液中的胞内酶有何意义？你还知道哪些类似的测定。许多器官组织的疾病常表现为血液中一些酶活性的异常，正常情况下，在组织细胞内发挥催化作用的酶在血清中含量甚微，只有组织器官受损造成细胞破坏或细胞膜通透性增高时，细胞内的某些酶释放入血，所以可通过测定血中酶活性判断病变的组织器官。乳酸脱氢酶 谷草转氨酶 Y-谷氨酰转移酶在赖氏法中， -酮戊二酸能否发生呈色反应，为什么？实验五 血清蛋白SDS-PAGE分析一、基本原理 l 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。l 聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。l 化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。具有分子筛效应。 l 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小 和形状等因素。l 如果向蛋白质溶液中加入足够量的SDS （十二烷基硫酸钠）和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。l 由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改 变，蛋白质SDS复合物形成近似“雪茄烟”为18A，这样的蛋白质SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不 再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。扩展内容l SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 l SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。l SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。l PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。l 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。l 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 l 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 l 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，具有分子筛效应。 l SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。l 在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。l 蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 三 思考题分离胶和浓缩胶的机制浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，具有分子筛效应。分子以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。实验六 色 谱 法一、色谱法的概念和特点色谱法又称层析法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名。他将植物叶子的多种色素装填于含吸附剂的柱子，并输入流动的液体，各个色素就以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（固定相；流动相）中的分布程度以及受流动相作用产生的推动力、固定相作用产生的阻力的不同，使各组分产生不同的移动速度，使得结构上只有微小差异的各组分得到分离。 在柱色谱法中，固定在管子(玻璃或不锈钢)的填充物(固体或液体)称为固定相，沿固定相流动的流体(气体或液体)称为流动相，此管称为色谱柱。在其它类型的色谱法(如：平板色谱法)也可照此类推。 色谱法是目前各种分离技术中效率最高和应最广的方法之。同时，它又能进行精确的定性、定量分析。在色谱分析中，通常是根据色谱峰的位置来进行定性分析，根据色谱峰的面积或高度进行定量分析。色谱法的特点：1、分离效能高：它能够很好地分离理化性质极为相似的混合物如同系物、同分异构体，甚至同位索，这是经典的物理化学分离方法不易达到的。2、灵敏度高：可检测10-11-10-13g的物质,适于作痕量分析。所需样品量极少，一般以ug计，有时仅以ng计。3、分析速度快：一般只霄几分钟或几十分钟便可完成一个试样的分析。4、操作简便、应用广泛：色谱法几乎能分析所有的化学物质。目前，成套的色谱仪有很多，它们大多具有高度自动化能力。色谱法的缺点：对未知物的结构分析比较困难。如果没有待测物的纯品或相应的色谱定性数据相对照，则很难从色谱峰给出定性结果。二、色谱法的基本原理 关于色谱法的基本理论主要有两个；(1)塔板理论。(2)速率理沦。其中前者是基础。限于篇幅，我们这里只讨论塔板理论。 在讨论塔板理沦之前，先谈谈什么是分配系数。 分配系数K： 分配系数是指在一定的温度和压力下，当分配体系达到平衡时组分在固定相中的浓度CS与在流动相中的浓度CM之比为一常数。此常数称为分配系数K，即 K值的大小表明被分离的组分与固定相分子同作用力的大小。K值小的组分在柱中滞留的时间短，较早地流出色谱柱；反之，K值大的组分在柱中滞留的时间长，则较迟地流出色谱柱。因此，不同组分的分配系数相差越大，越容易实现分离。 塔板理论： 这理论是从平街的观点来研究组分分离过程，由詹姆斯(James)和马丁(Martin)于1941年最先提出。他们将一根色谱柱比作一个精馏塔，柱内由一系列设想的塔板组成，把色谱柱分成许多小段，在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间为流动相占据。这样一个小段称作一个理论塔板。混合物组分随着流动相进人色谱柱后，在每块理论塔板高度间隔内很快地在两相间达成分配平衡，然后随着流动相按一块一块塔板的方式向前移动。经过多次分配平衡，分配系数小的组分先离开精馏塔，分配系数大的组分后离开精馏塔。 色谱分离的过程，实质上是各组分反复多次在两相中不断分配平衡的过程故塔板理沦也称作平衡理论。 有关塔板理论的进一步知识，如各种公式及计算是比较复杂的，这里我们不再提及。下面仅举一简单例子，以助于对塔扳理论的理解。例： 设某一混合物溶液中含氨基酸A和氨基酸B。氨基酸A的分配比(分配系数)为1:1；氨基酸B的分配比(分配系数为1:3)这两氨基酸的浓度均设为1它们在二相中的分配情况分别如下表：经过三次分配以后可以看出，氨基酸A在第二层浓度最大，氨基酸B在第三层浓度最大。可以推想，经过多次分配平衡后，氨基酸A和B将集中在不同的二点上，也即是将它们分离开了。同时，其余部位上的浓度也将接近于零。这里仅仅谈的是三个塔板，而一般的色谱柱少则也有几十上百个塔板，多则如高效液相储柱的有效理论塔板往往有5000-10000个，而实际柱长仅0.3米,因此，色谱法能分离理化性质极为相近的混合物就不难理解了。三、色谱法的分类 色谱法分类方法有多种，一般可按下达方法分类：1、按两相所处的状态分类： (1)按流动相的状态可分为气相色谱法和液相色谱法。 (2)按固定相状态的不同，气相色谱法又可分为气-固色谱法和气-液色谱法; 液相色谱法也可分为液-固色谱法和液-液色谱法。2、按色谱原理分类： (1)吸附色谱法：利用不同组分在吸附剂(固定相)上物理吸附性能不同而得以分离。 (2)分配色谱法：利用不同组分在两相中不同的分配系数而达到分离。 (3)离子交换色谱法：利用不同组分在离子交换剂(固定相)上的亲合力大小不同而达到分离。 (4)凝胶色谱法：利用不同组分分子的大小不同，在多孔性物质中受阻滞的程度不同而分离。又称分子筛色谱法。(5)亲和色谱:利用不同组分的与固定相的亲和力(如受体与其专一性配体)不同而达到分离。3、按操作形式不同分类：(1)柱色谱法：将固定相装在柱内。(2)平板色谱法：又可分为纸色谱法和薄层色谱法。前者是用多孔滤纸作固定相，后者是将吸附剂涂铺在玻璃板或塑料板上作固定相。根据以上分类，将各类色谱法列如下表；实验七 血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离一、实验目的1. 掌握凝胶层析的基本原理。2. 熟悉凝胶层析的操作过程。二、实验原理凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验用葡聚糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267）和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000）混合物作样品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢，后流出层析柱。这样就可分离核黄素和血红蛋白。六、思考题1比较凝胶层析与分配层析在实验原理上的区别。凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。分配层析指利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（固定相；流动相）中的分布程度以及受流动相作用产生的推动力、固定相作用产生的阻力的不同，使各组分产生不同的移动速度，使得结构上只有微小差异的各组分得到分离。2要使凝胶床达到实验要求，需注意哪些操作？操作要温和。凝胶床要整体均匀连续,不得有气泡、断纹与节痕。如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉。凝胶床表面要保留1cm高的缓冲液。在洗脱时，要将恒流泵至色谱桂的连接管内气泡全部排除，以免影响流速。另外务必防止流速过大以及过小，造成色谱床液体流干。为了取得良好的色谱效果，须在色谱前对所装色谱桂进行检查。首先观察色谱床是否均匀，床面是否平整，有无“纹路”和气泡等。实验八质粒DNA的PCR扩增一 实验原理PCR是体外核酸扩增技术。能在一个试管内将所有的研究目的基因或某一个DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。PCR要经过高温变性，低温退火，适温延伸。PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+（1）模板：单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100mL。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加（2）引物浓度：0.1-0.5 mmol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)：0.5-2.5 U/50 ml酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTP：dNTP浓度取决于扩增片段的长度，四种dNTP浓度应相等。浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产，dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5） Mg2+：Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。循环参数(1) 变性：使双链DNA解链为单链，95oC 20-30秒。(2) 退火：温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸： 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数：主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-35次。次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加。琼脂糖电泳琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。三 思考1、解释PCR的基本原理该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。2、PCR扩增与细胞内DNA半保留复制有何异同PCR技术 DNA生物复制环境 体外复制， 加热，90摄氏度左右 体内，温和的环境模板 DNA单链 DNA单链原料 4种脱氧核糖核苷酸 4种脱氧核糖核苷酸酶 主要是DNA聚合酶 DNA解旋酶，DNA聚合酶，DNA连接酶等各种酶引物 需要人工合成的引物 自己合成引物成分步骤 变性-退火-延伸 解旋-起始-延伸-结束原则 碱基互补配对原则 碱基互补配对原则综合性实验二：质粒DNA的限制性内切酶消化酶解限制性核酸内切酶1、 概念：是可以识别DNA上3-8个特异核苷酸序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。2、 用途：是分子生物学研究中的一种工具酶，在基因操作中，这些酶作为“剪刀”对DNA起剪切作用，是分子生物学研究中不可缺少的酶之一。粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。平头末端：是在同一位置上的切割双链，产生平头末端。平头末端连接效率之所以比较低，原因之一是在连接过程中只有连接酶的作用，缺乏粘性末端那样突出碱基的互补作用；原因之二是常用的T4DNAligase对于平末端的Km值比粘性末端高1000倍 ,Km值越大，酶与底物亲和力越小. 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。 用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。注意事项：1、限限制性内切酶保存在50%甘油中，高浓度甘油会影响酶效果和酶切的特异性，本酶切体系中总甘油浓度最多不超过5%为宜。 2、注意微量取样枪的使用，注意枪的量程，在取酶时，因为高甘油浓度，粘度高，易取酶过量，因此只须吸到酶就行，不要贪多。3、反应取酶时使用无菌吸头，以免污染酶液，同时因尽量缩短在温室的放置时间。4、反应物混匀时，应避免强烈震荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整反应前的低速离心式必要的，这可能使因混匀吸附于壁上的液滴全部至管底血糖测定（葡萄糖氧化酶法）实验方法：测血糖的方法：葡萄糖氧化酶法，邻甲苯胺法。后者测得的结果高于前者原理：GOD催化葡萄糖生成葡萄糖和过氧化氢、过氧化氢酶将过氧化氢、苯酚、4-氨基替安替毗林氧化缩合活红色琨式物质，在505nm最大吸收峰而A(葡)与其含量成正比。步骤：3管：1号空白管、2号标准管、3号测定管、加等量酶酚混合试剂于370C水浴一定时间，测得各试管吸光值 计算：血清葡萄糖量（mmol/L）A测/A标×C标 其中参考空腹血清葡萄糖为：3.89 6.11mmol/L空腹血糖浓度(mmol/L)×18=mg/dl正常血糖水为80120毫克100ml，临床意义：1、生理性高血糖;肾上腺分泌增加.2、病理性：糖尿病，高糖，胰岛素缺乏；内分泌功能障碍。甲亢，肾上腺皮质及髓质亢进；颅内压升高；脱水3、 低血糖：饥饿，剧烈运动4、 病理性低血糖：胰岛素分泌过多；肝病患者五、反应影响因素：酶促反应的影响因素：T、t；特异性反应，非特异性（第二步存在误差，致使其偏低） DNA质粒小量提取之碱裂解法实验方法：碱裂解法；煮沸法；羟基磷灰石结晶法方法步骤：细菌培养质粒DNA扩增；细菌收集和裂解；质粒DNA分离纯化思想：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异达到分离，在NaOH，SDS中裂解是蛋白质与染色体DNA变性，加入醋酸钾/冰醋酸中和液离心后染色体DNA沉淀而变性的质粒DNA又复性留在上清，故分离质粒DNA三种构象：最多是以共价闭环DNA，其次是Nick,然后是线性：(L-型) 电泳速度：超螺旋>线性>Nick注意最后一步操作是空离，目的是除乙醇泳动速度：超螺旋>线性DNA>开环DNA质粒的应用：大多数基因工程使用松弛型质粒。严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，PCR技术全称：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），一种体外核酸扩增技术典型的PCR:由模板高温变性、引物与模板退火和引物链沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。940C变性 540C退火 720C延伸结果分析：做此试验一定要将模板稀释足够倍数（10-100倍）PCR精度很高一个分子就可以复制出来，若没稀释DNA模板不能完全与引物结合，做琼脂糖电泳时会出现两条带。下面为所特定的DNA片段，上面是未酶切的DNADNA的复制 和 体外的模拟的比较模板（母链） 细胞内源 外源加入打开双链 解链酶 加热变性维持单链 单链结合蛋白 高温引物 引物合成酶 外源加入底物dNTP 细胞内源 外源加入聚合酶 细胞内源 外源加入反应环境 细胞内环境 缓冲液PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+模板单、双链DNA均可模板浓度过高会导致反应的非特异性增加引物浓度0.1-0.5 mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度PCR技术的应用1. PCR的应用于目的基因的克隆表达2. PCR的应用于临床检测3. PCR的应用于基因测序