2022年分子生物学实验理论考试 .pdf

2012-2013 学年第二学期分子生物实验考试题库1、PCR 原理是什么？答：PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法。 它的特异性是由两个人工合成的引物序列决定。引物就是与待扩增DNA 片段两侧互补的寡核苷酸。双链 DNA 是在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链DNA 分子（变性） ，两引物分别与两条DNA 的两侧序列特异复性， 在适宜条件下， DNA聚合酶以单链 DNA 为模板，利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸，在引物的引导下，按5 3 方向复制互补DNA ，即引物的延伸。在适宜的条件下，这种热变性 复性延伸的过程不断循环重复， 前一个循环的产物DNA 可作为后一个循环的模板DNA 参与 DNA 合成，使产物 DNA 的量按 2n 方式扩增。2、PCR 一般体系应加入哪些试剂？答：10*PCR 缓冲液（含 Mg+） 、模板 DNA 、四种 dNTP、一对引物、耐热Taq聚合酶。3、PCR 防止其它 DNA 污染，应注意哪些问题？答：标本放置时密封要严避免溢于容器外，容器要清洁避免造成相互间交叉污染；移液器使用要规范避免污标本间污染;无菌工作台操作， 避免气体中有杂菌。4、影响 PCR 产物产量的因素主要有哪些？答：引物、酶的种类及浓度、dNTP 的质量（优劣）与浓度、模板核酸的量与纯化程度、 Mg2+浓度、温度与时间、循环次数。5、引物设计应注意哪些问题？答：引物长度不宜过长20bp 左右较佳；引物扩增片段的长度以200-500 为宜；引物碱基的中G+C 的含量应在 40-60%为宜，G+C 太少则扩增效果不佳，G+C 过多则易出现非特异条带；避免引物内部出现二级结构，避免两天引物间互补，特别是 3端的互补否则会形成二聚体结构；引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基， 应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。6、简述克隆某一原核生物基因片段一般操作步骤？答：克隆某一原核生物基因片段是可用PCR技术对基因进行大量扩增，首先准备好实验材料大体为：需扩增的模板DNA 、DNA 聚合酶、 dNTP 混合液、 PCR缓冲液、引物等、其过程大体分为3 个步骤：第一步：变形：通过加热使DNA模板双螺旋链解离为单链，第二步：退火：当温度突然降低时。由于模板DNA结构复杂难再互补， 而引物建构简单且数量巨多易于模板DNA 互补杂交从而使引物结合到模板上DNA 上，第三部：延生：在DNA 聚合酶和四种底物及镁离子存在条件下 DNA 连开始延伸。 以上 3 个步骤为一个循环，数小时后即可得到大量扩增的目的片段。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 6 页 - - - - - - - - - 7、什么是质粒？质粒的基本性质有哪些？答：a质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA) 分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA 分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。 b 具有复制起点。 携带易于筛选的选择标记。具有多种限制性内切酶的切割位点。具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。8、质粒抽提实验中溶液I、II 、III 各有什么作用？答：溶液 I:由葡萄糖 ,EDTA,Tris Cl 组成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒 DNA;EDTA 的作用是络和掉 Mg2+等二价金属离子 ,防止 DNA 酶对质粒分子的降解作用;Tris Cl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适 PH 范围。 溶液 II: 由 SDS与 NaOH 组成.SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性;NaOH(pH12)的作用是破坏氢键,使 DNA 分子变性。溶液 III: 由 KAc 与 HAc 组成,是 pH 值为 5.5 的高盐溶液 .能中和溶液 II 的碱性,使染色体 DNA 复性而发生缠绕并使质粒DNA 复性.K+离子会与 SDS 形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去.溶液中的染色体DNA 也会与蛋白质-SDS 形成相互缠绕的大分子物质,很容易与小分子的质粒DNA 分离,此外,高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。9、碱裂解法抽提质粒DNA 的基本原理是什么？答：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA 之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。 PH 介于 12.012.5时，线性 DNA 变性，双链打开，而质粒 DNA虽变性，但两条互补链彼此缠绕，当PH 恢复到中性时，质粒DNA 可迅速准确的完成复性，而线性DNA 复性较困难，缠绕成网状，通过离心可沉淀除去。10、在碱裂解法提取质粒DNA 操作中应注意哪些问题？答： （1）正确使用移液器。（2）溶液 ll 必须新鲜配制。（3）加入酚 -氯仿后必须充分混匀。（4）混匀的过程不能太过剧烈。 （5）每次弃上清液时都应用移液器吸去管壁上黏附的水珠。 （6）吸取酚 -氯仿溶液时要将Tip 头插入液体分层的下侧。 【可根据第一次试验自己写的注意事项进行补充】11、在碱裂解法提取质粒DNA 时， 酚/氯仿的作用是什么？答：酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 的主要作用是抽提蛋白质12、碱裂解法提取的质粒DNA 分子一般有几种构象？电泳时移动速率有何差异？答：超螺旋 DNA线性 DNA开环 DNA 13、提取植物基因组DNA 的基本原理是什么？在操作过程中应该注意什么？名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 6 页 - - - - - - - - - 答：基本原理 :利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的 SDS 溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA 抑制DNA 酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA 溶液经异丙醇沉淀。注意事项 :材料要新鲜娇嫩，叶片研磨地越细越好；操作应为无菌操作；操作应温和，不宜剧烈晃动； 注意移液器的正确使用。14、在植物基因组提取过程中，DNA 降解的可能原因？答：原因 :从植物中提取DNA 时没对细胞内的DNA 酶进行灭活； 操作过程中被细菌污染了； 口水等含酶物质飞入样品中； 温度、PH 等变化过于剧烈。15、在植物基因组提取过程中，提高DNA 产量的措施？答：应当选取幼嫩的叶片，因为幼嫩叶片中的DNA 含量高些；组织抽提前要保存在液氮中，以免 DNA 被破坏；纯化时注意抑制核酸酶污染，使用EDTA 等防止 DNA 降解；整个实验过程应该温和操作，不能剧烈振荡，混合过程要轻缓，减少抽提，减少 DNA 片段被认为降解， 因为过度振荡会使DNA 断裂成小片段。16、在使用苯酚进行DNA 提取时应该注意什么？答：酚一定要进行碱平衡，苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜、眼睛会对人体造成损伤，应当注意防护；它是出去蛋白质的，要充分振荡使蛋白质变性，但不能太剧烈而打断DNA；离心后应该避免再次吸入有机相的苯酚氯仿，尽量只取上清，不应该让苯酚最后仍有残留，需抽提干净。17、在提取植物基因组DNA 过程中，使用苯酚与氯仿的作用是什么？答：用苯酚和氯仿抽取，去除多余的蛋白，保证提取的基因组较纯净。18、在植物基因组提取过程中，该如何检测和保证基因组DNA 的质量？答：检测：琼脂糖凝胶电泳；保证DNA 活性:用 EDTA 抑制 DNA 酶活性，从而保证 DNA 不被破坏。19、什么是限制性内切酶？答：限制性内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA 双链结构的核酸内切酶，有三种类型， 类， 类，类，他们都有甲基化修饰功能和限制酶功能， 类常用于分子克隆20、常见的型限制性内切酶切割双链DNA 后会产生末端或末端。答：粘性，平21、下列有关限制性内切酶的描述，错误的是：（C）A一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B限制性内切酶的活性受温度的影响C限制性内切酶能识别和切割RNA D限制性内切酶可以从原核中提取22、现有一长度为 l 000 bp的DNA分子，用限制性核酸内切酶 EcoR I酶切后得到的DNA分子仍是 l 000 bp，用Kpn I单独酶切得到 400 bp和600 bp 2种长度的名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 6 页 - - - - - - - - - DNA分子用 EcoR I，Kpn l同时酶切后得到 200 bp和600 bp 2种长度的 DNA分子。请画出该 DNA可能的酶切图谱。答：这是个大小为 1000bP的环形的 DNA 分子，在1bP处和400bP 处分别有一个 Kpn 位点，在 200bP处有一个 EcoR 位点。23、一个限制性内切酶的识别序列和切割位点是5一G GATCC 一3，在质粒上有该酶的一个切点， 请画出质粒被该限制性内切酶切割后所形成的黏性末端。答：-G GATCC-写在上面，下面为 -CCTAG G- 该酶为限制性内切酶I 24、基因工程中，切割目的基因和载体所用的限制酶及切口必备的特点是(A) A可用不同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同B必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端可不相同C必须用相同的限制性内切酶，露出的黏性末端必须相同D可用不同的限制性内切酶，露出不同的黏性末端25、在遗传工程技术中，限制性内切酶主要用于（D）A. 目的基因的提取和导入B. 目的基因的导入和检测C. 目的基因与运载体结合和导入D. 目的基因的提取和与运载体结合26、在分子生物学实验中，常使用微量移液器，请说明在使用微量移液器时需要注意什么？答：确定合适的量程，不可超过量程取液。取液时按到第一档， Tip 头垂直进入液面 3-5 毫米取液。移液器注意不能接触溶液。打出液体时贴壁并有一定角度，要按到第二档将液体全部压出。使用完毕后，打下 tip 头，放好移液器。27、现有量程为 0.1-2.5 l；1-10 l；2.5-20 l；10-200 l；100-1000 l的移液器各一支，请问，当吸取0.15 l，0.5 l，5 l，15 l，100l，750 l液体时，各需要选取那种最佳量程范围的移液器？答：分别是 0.1-2.5 ，0.1-2.5 ，1-10， 2.5-20，10-200，100-1000。28、本学期我们学习了CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞和热休克法转化质粒DNA，你还知道哪些方法可以制备大肠杆菌感受态细胞和转化的方法？答：氯化铷法，甘油聚乙二醇法，一步法29、在质粒 DNA 转化大肠杆菌时，是如何进行筛选的？答：因为质粒 pETBlue-2 带有青霉素抗性基因 ,所以转化成功的大肠杆菌细胞能在含羧苄青霉素的琼脂糖平板上生长形成菌落.所以用含羧苄青霉素的琼脂糖平板可以筛选出转化成功的大肠杆菌。30、蓝白班筛选的原理是什么？答：见实验指导92 面的实验原理的后半部分名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 6 页 - - - - - - - - - 31、在质粒 DNA 转化大肠杆菌感受态细胞时， 如果将用来浸泡玻璃棒的酒精引燃起火该如何处理？答：用水打湿的毛巾，着火时用毛巾盖上就行了32、卫星菌落出现的原因是什么？该如何避免？答：卫星菌落是氨苄降解后生长的杂菌。可能是感受态细胞的问题也可能是转化过程出现操作失误例如未在冰中进行转化，感受态在常温下放置过久失活，转化后摇菌时间过短，或者摇床速度过慢，没有把菌摇起来，如果不是转化过程出现的问题就要进一步考虑连接是否正确，连接时间1216h，体系一般6ul-10ul，目的片段：载体一般1:31:10。可以将培养时间控制在12h-16h之间 ，或者更换抗生素为羧苄青霉素。33、影响所制备感受态效率的因素有哪些？答：影响因素有（1）大肠杆菌生长状态 （2）氯化钙浓度 （3）冰上放置时间 （4）保存温度34、转化后为什么要温育1 小时？为什么加入的是无抗培养基？答：第一问：温育就是让感受态恢复一下状态，以及一些相关抗性基因的表达。毕竟从 -70环境中取出，需一段时间适应才可转化。第二问：因为细胞比较脆弱，加无抗培养基是为了让细胞生长，促使在转化过程中获得的新表型得到表达。35、如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？答：（1）操作过程仪器、器皿等不是无菌的，出现了一些杂菌和杂DNA 的污染 （2）细菌在感受态时发生了一些自然变异，对所加的抗生素有一定的抗性，所以长出一些菌落（3）所加的抑菌抗生素浓度不够，不能够抑制住细菌的生长 （4）一些实验误差，错将菌液放错36、 在转化实验中，实验组和对照平皿应有什么样的结果？如何解释这个结果？答：实验组中长出菌落而对照组中无任何菌落生长。37、在学习制备感受态细胞时， 为什么要保证细胞密度 108/ ml？甘油的作用是什么？答：细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，密度过高或不足均会影响转化效率，一次要保证细胞密度108/ ml。甘油的目的是为了防止水在冻结过程中产生过大的冰晶损伤细胞，抑制大肠杆菌生长，以便保存。38、通过分子生物学实验，你认为自己掌握了哪些实验技能？你对分子生物学实验有哪些建议与意见？答：此为主观题，可结合所学知识发挥，言之有理即可。（比如凝胶电泳， PCR扩增等。）这门课程将分子生物学实验操作的理论与实践相结合，不仅使我在分子生物学实验技能方面得到系统的训练，而且让我对具体实验操作的原理有名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 6 页 - - - - - - - - - 了清晰地认识。作为一门实验课，它还锻炼了我运用已学到的理论知识和已掌握的实验技能综合解决科学问题的能力。39、用琼脂糖凝胶分离DNA 的理论依据是什么？答：DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速率向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。40、为何在对凝胶进行操作时要带一次性手套？答：琼脂糖凝胶电泳时戴一次性手套能够有效阻止EB 的渗入。 EB 是强诱变剂并有中等毒性 ,配制和使用时都应戴手套41、DNA 分子在电泳缓冲液中带正电荷还是负电荷？它在电场中的移动方向如何？电泳中你观察到哪些现象？答：DNA 带负电荷，在电场中向正极移动42、影响琼脂糖凝胶DNA 迁移速率的因素有哪些？分别有何种影响？答：电压越大速率越大。DNA 分子量越小速率越大。DNA 的分子结构：超螺旋最快，线型次之，开环最慢。介质的种类和浓度。EB 电泳缓冲液43、若有 60 kb100 kb 大小的系列 DNA 片段要进行分离鉴定，应采取哪种类型的电泳方法才能进行有效分离？为什么？答：恒定电场强度下的琼脂糖凝电泳。糖凝胶可以制成不同大小的孔隙度，具有分子筛的效应，所以恒定场的琼脂糖凝胶电泳适于分离60kb_100kb 的 DNA片段， DNA 片段的迁移率和分子的大小和高级结构有密切关系。44、在质粒提起实验中， 用溶液 III 处理后，要进行离心分离。 此时，质粒 DNA分子在（上清液，沉淀物）中，细菌基因组DNA 分子在（上清液，沉淀物）中。答：上清液沉淀物45、在质粒提起实验的最后两步，要加入2 倍体积的乙醇和70%的乙醇溶液。这里不同浓度乙醇的作用是什么？答：无水乙醇的为了是沉淀DNA 继而达到浓缩 DNA 的目的， 70的乙醇是为了洗涤 DNA,进一步除去杂质。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - 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