2022年单分子荧光检测技术 .pdf

分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟 B200425010 单分子荧光检测技术涂熹娟 B200425010 【摘要】单分子检测技术有别与一般的常规检测技术，观测到的是单个分子的个体行为，而不是大量分子的综合平均效应。近年来随着相关学科的技术进步，单分子研究已经在从分子生物学到细胞生物学等生命科学领域有了迅速的发展和应用。本文简要介绍了单分子荧光检测技术的研究背景、意义、原理，以及该项技术进展和应用。【关键词】单分子荧光寿命荧光偏振单分子 FRET 1. 单分子检测技术的意义和发展背景1.1 单分子检测技术的意义在统计力学的各态遍历假设中，系综个体物理量轨迹的时间平均等于该物理量在给定时间的系综平均1。在一个包含完全相同个体的系综，当测量时间足够长的时候，系综测量和单分子测量结果相同（例如对于稀溶液中小分子的核磁共振谱线的测定，由于测量时间远大于小分子的翻滚时间，这时体系就可以看成是一个均匀的体系，并看作静态）；但是即使在均相体系中，分子本身并不是处于静态，而是在不断地运动，测量的参数具有涨落现象，而测量时间可能会小于分子的涨落时间；另一种情况是在非均相体系中，个体轨迹平均本来就不等于系综平均（实际上几乎所有生物体系都不是均相体系）。这以上考虑到的两点都导致系综测量结果和单分子测量结果不等。一般系综测量结果表示的是大量由一种或多种对象组成的一个整体所表现出来的平均效应和平均值。这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。而这些特殊的信息有时是非常名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 11 页 - - - - - - - - - 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟 B200425010 重要的，尤其在研究具有非均匀特性的凝聚相物质和生物大分子结构时。而相比之下，单分子检测就可做到对体系中单个分子的行为进行研究，可以得到在特定时刻，特定分子的特殊位置和行为，因为在某一时刻，集团中的任何成员只能处于一种状态。将此再与时间相关，还可得到单个分子的行为的分布状况。这样我们就可以同时得到所研究的对象的整体行为和个体行为了，然后将数据综合处理，得到更为全面的信息。1.2 单分子检测技术的意义和发展背景 既然单分子检测技术有这么多的好处，为什么直到近年来才逐渐发展起来呢？这与光学系统的进展有很大的关系。其实人类很早以前就有探索微观世界奥秘的要求，但是苦于没有理想的工具和手段。 直到世界上第一台可以被称为显微镜的仪器在1675年由荷兰生物学家列文 虎克制 作出来。在以后的几 百年，人们一直 用光学显微镜观 察微观和探索 眼睛看不到的世界， 但是光具有 波动性使光学显微镜的分 辨率只能达到光波的半波长左右，人类的探索因此 受到了限制。即使消除掉透 镜形状的缺陷，任何光学仪器 仍然无法完美的成像。人们花了很长时间才发现，光在 通过显微镜的时候要发生衍射，即物体上的一个点在成 像的时候不会是一个点，而是一个衍射光斑。如果两个衍射光斑靠得太近， 你就没法把它 们分辨开来。 显微镜的 放大倍数再高也无济 于事。对于使 用可见光作为光 源的显微镜， 它的分辨率极限 是 0.2 微米。任何小于 0.2 微米的结构都没 法识别 出来。提高显微镜分 辨率的途径之一就是设 法减小光的 波长， 或者，用电子束来代替光。根据德布罗意的物质 波理论，运动的 电子具有 波动性，而 且速度越快，它的“波长”就越短。如果能 把电子的速度加 到足够 高，并且汇聚它，就有可能用来放大物体。进人 20 世纪，光电子技术得到了长足的发展，1938年，德国工程师 Max Knoll 和 Ernst Ruska制造出了世界上第一台 透射电 子显微镜（ TEM） 。几十年来，又有许多 新型的显微镜 问世，1952 年，英国工程师 Charles Oatley制造出了第一台扫描电 子显微镜（ SEM） 。电子显微镜是 20世纪最重要的发 明之一。由于 电子的速度可以加到很高，电子显微镜的分 辨率可以达到纳米级 （10-9m ） 。很多在可 见光下看名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 11 页 - - - - - - - - - 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟 B200425010 不见的物体 例如病毒 在电子显微镜下现出了 原形。用电子代替光，这或许 已经是一个 反常规的主意，但是还有更 令人吃惊的：1983年，IBM 公司苏黎 世实验室的两位 科学家 Gerd Binnig 和 Heinrich Rohrer 发明了所谓的扫描隧道 显微镜（ STM） 。这种显微镜比 电子显微镜更 激进，它完全失去了传统显微镜的 概念。正是近年来这些在光谱学和光学显微镜 方面的进展，使得在表面和溶液中检测和成像单分子成为了可能，而且可以对单分子的光谱性质进行检测并实时监控其动态 过程。使得我们 终于可以看清单个分子与时间相关的行为，排除测量中的平均效应，发展单分子检测技术。2. 单分子检测技术的原理2.1 单个分子的荧光产生原理Fig.1 单个分子的 荧光产生原理单分子的 荧光产生原理如 Fig.1 所示2：S0，S1，S2分别为基态、第一激发单重态 、第二激发单重态， T1为激发三重态。分子 吸收一个光子 hA后，被 激发到较高的电子态 S1或 S2以上的能 级后又快速弛豫 到 S1的最低振动能 级，然后发 射一个荧光光子F，同时使分子 弛豫 到 S0的较高振动能 级，最后快速弛豫 到 S0最低振动能 级。由名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 11 页 - - - - - - - - - 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟 B200425010 于弛豫过程造 成了能量 损失，因此荧光光谱发生 红移。同时，分子也可能从 S1无辐射系间窜跃到 T1，由于 自旋禁阻 ，其速度远低于从 S1到 S0的辐射跃迁 时间。然后 从三重态弛豫到基态并发 射一个磷光光子 P。单重态 向三重态的 跃迁会降低分子的荧光量子 产率和缩短分子的 荧光寿命，当处于 S1态的电子弛豫到 T1态时，分子的 荧光很弱，乃至没有荧光，形成荧光暗态。一 旦当电子从 T1态回到 S0态时，分子处于 新的一轮激发和发 射的循环过程 。因而形成一个发 射暗态交替的量子 跳跃过程 ，这种量子跳跃过程 是单分子 荧光的主要特征之一3。这一重要特 征导致了实 验中观察到的单分子 荧光光谱和 荧光强度的涨落现象， 并主要取决于单分子的 局域环境及 其淬灭途径。因而测量单分子的 荧光量子 跳跃过程、荧 光寿命和荧光量子 产率可以提供很多关于单个 荧光分子所在的 局域环境 的特性和 变化情况的信息 . 单个荧光分子还具有 唯一的固有荧光吸收跃迁偶极矩 ，分子只 吸收那 些偏振方向与其吸收跃迁偶极矩方向 一致的光子，然后发出具有一定偏振方向的荧光。荧光的偏振特性是单分子的另一重要特征4。在单分子探测的 广泛应用中，人们 正是利用这种单个分子 跃迁偶极矩 的方向以及分子所处的 环境的差异来研究和 推测生物大分子的结构和 功能。以上是单个分子的 荧光产生原理。在单分子的实际 荧光检测中是 用激光激发荧光分子或 用染料 分子标记了的其 他分子，分子发出 荧光。由于 荧光物质 通过激 光束的时间( ms 级)比荧光的激发态寿命( ns 级)大得多，因此一个 荧光物质分子在 通过激 光束的过程中可以被 反复激 发而在 基态 S0和电子激发态 S1之间反复循环 ，发射出大量的荧光光子，即“光子爆发” 。通过这种在 短时间内发出大量光子的 “光子爆发”现象5可以把单个荧光物质分子的 荧光同很 强的背景杂散 光区别开 来，从而有效地探测单个荧光分子，并从这样的 爆发中获取研究对象的相关信息。 荧光分子在 激发光的 照射下，反复经 历多次激发、发射过程 后，往往造 成分子 内部结构发生不可 逆的变化，不能吸收更多的光子而进一 步发射荧光。这时就称该分子被光 漂白了。我们 希望一个荧光物质分子在 通过探测灵敏区 时能够 辐射尽可能多的 荧光光子，这 需要提高激 光功率。而当激光功率高 时，荧光分子有可能在 通过探测灵敏区 的途中被漂白了，信噪比反而下降。因此，在 通过“光子爆发”提高荧 光信号的同时， 选择一个好的 荧光分子和 选取名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 11 页 - - - - - - - - - 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟 B200425010 合适的激光功率以避免“ 光漂白”6也是非常重要的。2.2 单分子检测技术的关键将荧光基团标记在生物大分子上，可以 通过其各种特性的 变化来反映有关分子间的相互作用、酶活 性、反应动力学 、构象动力学 、分子运动 自由度及在化学和静 电环境下活性改变等信息。并 且标记 上去的荧光团对 宿主的性质 影响很小。在稀溶液中，吸光光度法检测单个分子的 吸光值的 准确度较低 ，而荧光发射检测因 背景值较低，所以较为灵敏，信噪比较高。正如 Keller 所说“单分子检测能力的 高低与其说是检测 灵敏度的提高，不如 说是背景噪 音的降低”7 对单分子 荧光的探测 必须满 足两个基本要求8： （1）在被 照射的体积中只有一个分子与 激光发生相 互作用，这一点可以很 方便地通过调整研究体系的 浓度（密度）来达到； （2）确保单分子的信 号大于背景干扰信号。可以通过减 少拉曼 散射、瑞利散射及其杂质荧光所造成的干扰来达到。杂散光背景是影响单分子 荧光检测信 号的重要因素。为了有效地检测单个分子，必须大大降低杂散 光的干扰。背景杂散 光的主要来源为：溶液瑞利散射 光、拉曼散射光和光学器 件的散射光。单分子检测在 降低由瑞利散射、拉曼散射及 溶剂杂质荧光产生的背景干扰时，因为单分子信 号与探测体 积无关，而背景则正比于探测体 积，所以为减少单分子检测时 背景杂散 光的干扰，采用了降低探测体 积这一有效 途径。因此，要 获得理想的信 噪比需要将激发体积最小化。目前文献报道的流体聚焦法的检测体 积可达到 110pL 的级别；微滴法也可达到 pL 级，共聚焦显微法的探测体 积则在 fL 至亚 fL 级， 因此背景可忽略不计，具有很 高的信噪比，但这种 方法由于布 朗运动导致分子进 入探测区域的概率较 小，使得分子检测的效 率较低。如何平衡检测体 积的减小与检测效 率的提高亦是单分子检测技术 亟待解 决的问题之一。另 外，还有人使 用毛细管 和微通道来达到降低检测体 积的目的。为了 消除杂散光，还可以 采用的方法5：(a)光谱滤波：有滤光片去掉其它颜色的杂散光（如瑞利散射光，光学器 件散射光，溶液 杂质的荧光） ；(b)利用荧 光和杂散光在时间特性上的 区别来消除拉曼散射光。由于 荧光强度是一条指数衰减曲线，荧光发射有几个 ns的延迟，因此采用高重复频率的激光器并结合时间 门符合技术可以 把单个染料分子的 荧光名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 11 页 - - - - - - - - - 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟 B200425010 信号同很强的背景杂散 光区别开 来。3. 单分子检测技术目前用于单分子研究的技术很多，包括观察其构象的 变化、功 能活动，以及与其它分子相 互作用的动力学 过程，可揭示出过去检测多分子集体行为平均化所掩盖的“个性”和蕴藏的丰富信息，从而深入了解生命活动的微观 规律。可将其 归纳成以下两个方面：扫描探针技术和光学和光谱技术。在扫描探针技术中， 主要有扫描隧道 显微技术 (SEM)、原子力显微技术 (AFM) 和扫描 离子电导显微镜技术 (SICM)等相似技术家族。而在光学和光谱技术中，则包括了扫描近场光学显微技术 (SNOM)、光钳技术(OT)和荧光技术 (Fluorescence) 。而且现在根据需要，还发展出各种组合技术， 如 AFM/光钳、SNOM/共焦显微术 、SNOM/FRET 等。STM 利用针尖与样品在近距时的隧道电 流，AFM 利用针尖与样品直接接触 时的力，SICM 利用针尖与样品间的电导达到成像的目的。由于这类技术可在常 温常压下进行，而且分辨率很高(10-910-10m 水平)，因此对于显示单个分子的 形貌具有很大的优越性。目前应用 AFM 比较普遍，它不仅可以观 察处于溶液状态的单个分子，更接近于生理状态，而 且可以测量力谱，即和大分子一部分接触，并通过施力与距离的关系了解分子的力学性质，特 别适合于对生物分子 折叠与解折叠 的研究。各种形式的扫描探针显微技术 较常规的光学显微技术有更 高的空间分辨率，但在获得高分辨的同时，这些 方法却失去了光学显微技术的许多 优点，如：对试样的无损伤性，试样能置于 空气中分析，仪器设 备价廉 、易操作、分析精度高、速度快 等。尤其是前 三种优点使光学显微技术具有 强大的生 命力和吸引力。在单分子检测的光学和光谱技术中， 扫描近场光学显微技术能够 获得超过光学衍射限 的超高分辨。扫描近场光学显微技术的近 场是指光源与样品间的距离接 近到纳米水平，而且光源通过针孔甚至光纤的尖端加以限制，以致通常光学显微镜因为光的 衍射现象而 受光波波长的限制被打破，分辨率不再决定于波长，而由光 源尺寸和光源-样品的间距决定，因而可以 达到几十纳米 的分辨率。光钳技术是 利用激 光通过透 镜后产生的力 场，使样品因形成偶极子而在力 场作用名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 11 页 - - - - - - - - - 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟 B200425010 下聚集于焦点的办法来操纵分子。光钳对微粒的操纵不是刚性的，而是像个弹簧，可以在操作过程中实时测量微粒间的微小相互作用力。可以说即是机械手，又是力的微探针。光钳作为“机械手”对生物微粒的生命活动的干扰极小，在整个操作体系涉及的细胞生存环境几乎等同与“天然”环境，细胞等的生命活动的变化得以完整保留并实时动态的展现给研究人员，是生物微粒静态和动态力学特性的理想研究手段。这对生物大分子行为的研究有很特别的意义。光钳作为力的探针，可以追踪在生物大分子进行各种生化过程的同时，生命过程的运动（位移和速度）、受力的大小和方向、彼此间的结合与分离等运动学和动力学特征，并使这些生命活动成为可控的，使得对它们的个体行为的研究真正从“观测”上升到“科学实验”，是研究活体生物微粒在生命活动中非常理想的一种手段。4. 单分子检测技术在研究中的应用荧光技术在群体测量中早已是一种很成熟的技术，但要达到测量单分子这一目的还必须采取一些新的措施，例如尽可能减小受激发样品的体积3、利用高效率收集光子的方法、应用高量子产率且低噪声的探测器（例如电荷偶合探测器和雪崩光二极管探测器） ，同时尽可能减小杂质和材料的本底荧光等。总的来说就是要尽可能的降低由瑞利散射、拉曼散射及溶剂杂质荧光产生的背景干扰，加强对溶液中的单分子的识别。在单分子荧光检测中，通常采用激光作为激发光源，形成“光子爆发”。依据荧光寿命和分子在激光束中停留时间， 可以算出单个分子发射的最大光子数为105106。目前光学检测系统收集、检测光子的效率约在1%左右，故单个分子仍可被检测到数千光子信号。在满足上述 条件下应用集体探测中的一些原理，如能量 共振转 移、荧光偏振测距离与取向等就可进行单分子检测。4.1 利用荧光寿命进行单分子荧光检测 不同探针分子的荧光寿命 也不尽相同。通过测量单分子的荧光寿命可用来区分不名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 11 页 - - - - - - - - - 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟 B200425010 同的分子。且这种方法 只需单束光源和一个检测通 道，使用脉冲激光和时间相 关检测出被检光子的到达时间，然 后作出到达时间的 直方图即可以得出荧光寿命。并且单分子的荧光寿命在由非 辐射弛豫决定 时对局域环境非常 敏感，因此可以通过荧光 标记生物大分子的 某一特殊位置，检测生物大分子的 构象运动。Sauer 等人9利用荧光寿命的不同将水溶液中的 Cy5-dCTP，MR121-dUTP和Bodipy-dUTP区分开。4.2 利用荧光共振能量转移进行单分子荧光检测 虽然荧光能量 共振转 移早已作为一种有效的光 谱尺度用于聚集体，可测 定 110nm之间的距离，但它对于给体与受体分子 之间相对运动的动力学 事件则无 能为力。这是因为大量分子 缺乏同步化所造成的。只有在实现 了单分子对 FRET 测量后，才有可能观 察到毫秒时间尺度内生物大分子 催化、折叠等过程中 构象变化的动力学过程。所谓单分子对荧光 共振能量转移就是在一个生物大分子或两个相互作用的分子上 标记两个不同的荧光 基团，一个在能量 转移过程中 提供能量，即供体；另一个接受能量，即受体。受体的 吸收光谱与供体的发射光 谱相重叠。由于偶极 偶极相互作用，能量从供体传递到受体。这样，通过检测能量传递效率，可 确定两 点间的 距离，并且通过监测能量 转移效率 随时间的变化可以 推测由生物大分子在生命活动中构象变化所引起的两点间的 距离的变化。最早实现这种测量的是Ha T 等对固定与硅烷化玻璃片 上DNA 的相隔 10 到 20个碱基对分别被 TMR(tetramethyrhodamine)荧光分子作为 供体和Texas Red荧光分子作为受体 标记后 进行 FRET 测量10。Nobuaki Soh等11则是观察到被两个胸腺嘧啶连接 的 6FAM 和 5TAMRA 分子能 够发生由 6FAM 分子向 5TAMRA 分子的能量 转移。当在 6FAM 的激发 波长处 激发时，得到的是 5TAMRA的发射光 谱。若溶液中有 OH 自由基等存在， 胸腺嘧啶之 间的键则会断开 ，能量 转移的途径被截断，这时，在 6FAM 的激发 波长下，观测到的是在 6FAM 的发射 波长的荧光。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 11 页 - - - - - - - - - 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟 B200425010 Fig.2 6FAM 和 5TAMRA 单分子对 之间的共振能量转移4.3 利用荧光偏振进行单分子荧光检测 单分子荧光 偏振是获得分子有 关取向的动力学过程的 重要方法。在前 面提到过，荧光分子 只吸收偏振方向与 其跃迁 偶极矩方向一 致的光子，并发出 具有一定偏振 方向的荧光。如 果固定 激发光的 偏振方向，对于 标记于生物单分子的 某一特殊位置的荧光分子， 其荧光强度就 会随着 生物单分子在生化 反应过程中 构象的涨落（旋转、扩散）的变化而变化。 若以线偏振 光源激发，发射荧光的 垂直分量和 水平分量由不同的检测器收集，通过 公式便 可计算出其荧光强度。 Seidel 等12用此法 区分了罗丹明 123和黄荧光蛋白。Joseph N. Forkey 等11用此法 证明了肌球蛋白 V分子是 按照“ 杠杆臂 ” 假说“ 行走” 的。并且 其轻链每摆 动一次便会 向前移动 36-37nm，这个数据和 其结构或是所处的生化环境 无关。其步行和 ATP 的水解偶合，即每向前迈一步，便伴随着 一个 ATP分子水解和一个 ADP 分子的结合。在 ATP 循环过程的大 部分时间中， 肌球蛋白 V 分子的轻链结合在 肌动蛋白上。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 11 页 - - - - - - - - - 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟 B200425010 Fig.3 肌球蛋白 V 的单分子荧光 偏振信号5. 展望单分子的研究 近年来的迅速发展 标志着 生命科学研究等 领域一个新的 阶段的到来。该技术目前已在从分子生物学到细胞生物学等学科的一些重要的领域有所应用，将生物大分子的个体动力学行为真实地展现在科学 工作者面前。但我相信这还 只是一个好的开头，随着相关学科的发展，以及单分子科学研究的深入，单分子检测技术必将有更加诱人的前景。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 11 页 - - - - - - - - - 分 子 发 光 分 析 涂熹娟涂熹娟 B200425010 参考文献1Xie X S, Trautman J K. Annu Rev Phys Chem, 1998, 49:441 2 陈国珍等，荧光分析法（第二版），19903Nie S M, Zare R N. Annu Rev Biomol Struct, 1997, 26:567 4Moerner W E. 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