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Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-dateMicroRotoforTMCell培训教程Micro Rotofor TM MicroRotofor TM Cell培训教程Bio-Rad2008年6月目 录 一、 仪器清点和客户实验准备二、 实验装置安装和实验操作三、 拆卸和清洗四、 故障排除五、 订货信息一、 仪器清点和客户实验准备1. 仪器清点1.1 MicroRotorfor Cel电泳仪主要部件图1 Micro Rotofor分离器的主要部件与附件(1) Micro Rotofor分离器底座与盖子，(2)收集盘，(3) 聚焦槽，(4a) 阴极，(4b)阳极，(5a)阴极膜，(5b)阳极膜，(6)10ml注射器，(7)3ml注射器，(8)镊子，(9)装配支架，(10)密封带，(11)清洁刷，(12)真空软管，(13)真空槽Micro Rotofor分离器底座与盖子图2 底座部件 (1)位于真空腔的组份收集盘，(2)收集配置，(3)致冷区域，(4)电源接口，(5)致冷开关，(6)电源开关，(7)橡胶塞接口1.2用户自备PowerPac HV/PowerPac Unversial电源；真空泵：可以提供22-27 Hg真空度的真空泵都可使用；真空阀和真空管；电解液用于平衡离子交换膜：0.1M H3PO4与0.1M NaOH各6ml；20ul，100ul，1000ul移液器；移液器头；50ml烧杯2. Micro Rotofor TM Cell start kit主要组成试剂盒主要组成如下： Bio-Lyte pH 3-10 两性电解质，10ml（Catalog #163-1112） 标准蛋白质样品，1ml（Catalog # 170-2919） 藻青蛋白2mg蓝色蛋白pI 4.5-5.5,血色素2mg红色蛋白pI 6.0-7.5,细胞色素 C质2mg橙色蛋白pI 8.0-9.0 聚焦槽（1） 阳极膜（阳离子交换膜）：2个，在15ml 0.1M H3PO4 电解液中平衡 阴极膜（阴离子交换膜）：2个，在15ml 0.1M NaOH 电解液中平衡 收集盘（1） 样品上样注射器，3ml（1） 电解液加载注射器，10ml (1)二、实验装置安装和实验操作2.1 概述1. 在特定电解液中平衡离子交换膜过夜(用Start Kit实验可略过此步)2. 组装聚焦槽并密封取样出口3. 将样品加入到聚焦槽中并密封上样口4. 在电极槽中加入电解液5. 将聚焦槽放入Micro Rotofor分离器底座，开始等电聚焦6. 切断电源，取下盖子并将Micro Rotofor分离器与真空泵相连7. 取下聚焦槽上的样品槽盖，并将其与收集装置连接8. 将分离的样品组份吸入收集盘（本实验以Micro Rotofor Cell Start Kit 170-2804为例）2.11 离子交换膜的平衡 (使用Start Kit可跳过此步)第一次使用的离子交换膜必须在电解液中平衡过夜（表3.1）。离子交换膜保存在电解液或去离子水中可以循环使用4-5次。注释：膜在干质状态可无限期保存。平衡使用后必须保持湿润保存，否则膜易干裂引起电解液向聚焦槽的泄漏。表3.1 离子交换膜以及其平衡条件 其他电解液见6.5膜颜色（包装）电极电解液阳极膜（阳离子交换膜）红色阳极0.1M H3PO4阴极膜（阴离子交换膜）黑色阴极0.1M NaOH2.2 组装聚焦装置这步操作中包括如何放置电极膜以及电极槽和聚焦槽的组装。1. 使用去离子水清洗电极膜（离子交换膜）2. 分别将阳极膜（红色包装）和阴极膜（黑色包装）嵌入聚焦槽两端（图2） 图2 将阳极膜嵌入聚焦槽一端3. 将电极槽与聚焦槽组装a. 聚焦槽的阳极膜端连接电极的阳极（指示红色端）b. 聚焦槽的阴极膜端连接电极的阴极（指示黑色端）4. 调节聚焦槽的上样口使其与电极的通气孔成一直线。（图3） 图3使聚焦槽的样品槽口与电极的通气孔成一直线2.3 准备并加载蛋白样品 蛋白样品制备：Start Kit中有三种有颜色的蛋白即藻青蛋白（蓝色蛋白），血色素（红色蛋白），细胞色素 C（橙色蛋白）。混旋样品后，取100ul蛋白样品（600ug），加入150ul Bio-Lyte pH 3-10 两性电解质，最后加入2.75ml去离子水使最终体积到3.0ml。再混旋使样品溶液混合均匀。加样：聚焦槽有两排出口，其中一排与电极通风孔成一直线用于加载样品，而与其相对的另外一排出口则用于样品的收集。在加载样品前将取样口端密封。加载样品后，加载口端同样要求密封。1. 利用工具附件的模板剪裁核实的密封条带，用于对聚焦槽出口的密封。见图4。图4 利用模板剪裁合适长度的密封带2. 用密封带密封取样口，见图5。保证密封带恰好把取样口密封，不要剩余很多否则在仪器振荡时，容易松动，产生泄漏现象。图5用密封带密封取样口3. 用载样注射器吸取3ml样品溶液，从位于聚焦槽中央的载样口上样，至样品溶液全部均匀渗透到各个腔体内（见图6）；或者采用在不同载样口上样，至样品溶液在聚焦槽各个腔体分布均匀。注：在上样过程中注意不要产生气泡，否则样品溶液在各个腔体内分布不均匀。如果出现气泡，可以将样品吸出，从另外的载样口上样，注意同样不能产生气泡。图6 在聚焦槽中加载样品4. 加载样品后，核实每一个聚焦腔体内是否充满样品溶液，并保证无气泡。如果存在气泡，将影响后续的分离，因此请按上步措施进行处理。5. 擦干聚焦槽外部，用密封带将上样口密封。不要使用过长或过宽的密封带，否则在仪器振荡过程中，密封带松动，容易产生溶液泄漏现象。2.4 聚焦实验1. 首先将致冷装置上的旋钮旋开。2. 将聚焦装置放入仪器底盘，聚焦槽上样口端和电极通气口端向上。核实阳极端（红色端）在左，阴极端（黑色端）在右。 轻轻将阳极推入底盘的阳极连接口（见图7）。 将聚焦槽放入致冷模块中并将阴极端轻轻滑入底盘的阴极凹槽中（见8）。旋转聚焦装置使该装置与底盘凹槽更好吻合；或开动振荡装置，通过轻微振荡使其吻合。图7将聚焦装置放入仪器底盘的阳极端 图8将聚焦装置滑入仪器底盘的阴极凹槽3. 用10ml 注射器向电极中加入电解液（图9）。 注释：可以使用膜的保存液，或者使用新鲜电解液 在阳极通气口处（红色），向内加入6ml 0.1M H3PO4 电解液在阴极通气口处（黑色），向内加入6ml 0.1M NaOH电解液 图9 向阳极加入阳极电解液4 加盖致冷装置盖子，并旋紧螺杆。5. 加盖仪器盖子6. 连接Micro Rotofor TM分离器底盘后电源线和电源插座7. 连接Micro Rotofor TM分离器到真空装置。（最好在连接中有阀门可以控制。）注意：在分离结束收集样品时才使用真空装置。8. 将开关“ON”，打开振荡装置9. 根据实验需要将致冷开关设置到（10）或（20）,本实验是（20），设置为（10）时，请将系统平衡约15min后再进行聚焦分离过程。设置为（20）时，可直接使用。注：用户根据所分离的蛋白设定不同的温度（20）适用不要求非变性蛋白质样品，如IEF（10）适用于非变性蛋白质样品，如蛋白质活性和结构分析等 关闭致冷系统。由于仪器运行时会产生大量热量，损害本仪器，不提倡使用。10. 将仪器盖子的电源口端插入电源，并调节到恒功率状态即1W。如果电源不能满足要求请参照3.5节进行多步恒电压程序。11. 整个聚焦过程大约需要3h。通过观察电压变化过程，可以指示聚焦是否完成。如果电压稳定于某一值时，继续聚焦30min后收集组份。过长的聚焦时间不但不能提高聚焦效果，还会引起pH梯度的下降。12. 同时该聚焦过程可以通过样品中蛋白颜色的分离来观察。藻青蛋白有三个等电点即4.5、4.7、5.0，向阳极移动，预期在#3腔体中聚焦。血色素A和血色素C等电点分别是7.1和7.4，向中央移动，预期在#6、#7中聚焦。细胞色素C，等电点为9.6，向阴极移动，预期在#9或#10中聚焦。2.5电源条件恒功率推荐使用恒功率进行操作。下表详细表述了致冷设置信息，室温控制在19-26。致冷设置致冷设置功率恒定1W恒定1W电压100-350V100-500V内部温度10±220±2多步恒电压如果电源不能使用恒功率参数，请使用限电流下进行多步恒电压操作。推荐使用恒电流20mA和恒功率2W。下表对不同体系样品进行了详细的使用分析。对于含有2.5mg蛋白质的2% (w/v) Bio-LytepH3-10体系采用致冷设置，或7M尿素、2M硫脲、2mM TBP、4%CHAPS、2%(w/v)Bio-LytepH3-10体系采用致冷设置。根据蛋白质载样量、两性电解质的含量、pH范围的不同使用不同的电流范围，并需要不同的分离时间。表3.4 多步恒电压设置步骤致冷设置致冷设置电压/时间电流电压/时间电流1150V/15min10-5mA150V/10min8-3mA2200V/15min7-2mA200V/10min4-2mA3300V/20min3-2mA300V/60min4-3mA4350V/20mn3mA5400V/60min3mA2.6 组份收集为防止样品扩散，聚焦结束后马上收集样品组份。1. 切断电源2. 切断振荡器和致冷装置的电源，打开Micro Rotofor TM分离器顶盖3. 核实Micro Rotofor TM分离器与真空装置相连，以及收集装置妥当4. 打开致冷装置顶盖，用镊子将密封带取下5. 打开真空装置6. 将聚焦装置小心的从仪器电极连接处取下，该过程始终保持聚焦槽样品槽口端向上（其密封带已经取下）。7. 将聚焦装置放入收集装置顶端见下图。调整聚焦槽使其成水平，使排针与取样口平行，不要刺破取样口的密封带。8. 双手控制聚焦槽并向下方按下，使排针刺穿取样口的密封膜。过程中不能堵塞聚焦槽上样口。同时用双手的拇指将收集盘插入真空装置。9. 继续按压聚焦槽数秒，使分离的样品组份吸入收集盘10. 取下收集盘，关闭真空装置11. 用注射器或移液器将各组份样品转移到其他容器中三、拆卸和清洗31聚焦装置拆洗1. 用工具将电极装置与聚焦装置拆卸分离2. 用镊子将离子交换膜取出并放入去离子水或各自电解液中进行保存注释：平衡后的离子交换膜要求放在离子水或各自电解液中保存，如果保存不善引起膜的失水，膜将产生龟裂，从而引起电解液渗入聚焦槽，影响分离结果。3. 用去离子水清洗电极装置4. 将聚焦槽浸入2%SDS溶液过夜后用去离子水充分清洗32收集装置折洗收集结束后马上进行取样针的清洗以保证取样的重复性。使用温和洗涤剂对针进行清洗。1. 拆卸真空装置与底盘2. 旋开螺丝将取样装置从真空装置上取下，先后取下定位模具、排针和排针架3. 清洗并晾干定位模具4. 用洗瓶清洗排针上的每根取样针5. 清洗并晾干真空槽6. 检查更换真空垫圈7. 组装收集装置四、故障排除4.1 分离过程中蛋白质沉降按其等电点定义，蛋白质等电点时本身不带电荷。如果蛋白质本身不带电荷，那么其疏水作用力将大于静电排斥力，从而溶解度降低，发生蛋白质沉降。在等电聚焦分离过程中经常产生“等电点沉降”。如何维持蛋白质在溶液中的溶解性6.2节给出了一些提示。在Micro Rotofor分离器分离过程中加入增加蛋白质溶解度的试剂（6.2）由于蛋白质固有溶解度不同，因此对于该问题没有特定的答案，完全依靠经验进行摸索。采用分析型IEF胶对少量样品进行分析以比较感兴趣蛋白质的溶解性。降低蛋白质样品的载入量，以保证良好的溶解性。4.2 影响pH梯度的因素由于样品制备问题、Micro Rotofor分离器的不恰当使用都会产生非线性的pH梯度。具体因素如下：电解液泄漏：电解液通过离子交换膜渗漏到聚焦分离腔内将会引起pH梯度变化，降低样品间的有效电压。通常使用了有裂痕、脱水的或使用旧的离子交换膜（catalog #170-2833）。如果保存方法妥当（3.11节），一张膜可以使用4-5次。不平均收集：收集体积的变化将明显影响组份的线性梯度。过早收集：在聚焦未完成时收集各组份，将影响pH梯度的线性以及蛋白的聚焦。（如何提高收集率详见7.6）样品中盐离子过高：一个高电压梯度以及在pH梯度范围内保持最多的分离数目，可以保证有很好的分辨率。但是如果样品中含有很高的盐离子，它将降低聚焦分离腔内的有效电压并降低线性pH梯度范围内组份的数目。可以使用两性电解质代替盐离子来增加离子强度，以利于保证蛋白质良好的溶解性（6.2节）。样品中缓冲溶液浓度过高：蛋白样品中过量的缓冲成份会使pH梯度趋于水平。pH梯度将在缓冲溶液的pKA产生缓冲，使各分离组份具有相同pH值。两性电解质的影响：两性电解质的质量影响到pH梯度的线性范围和重复性。每一批次以及不同生产厂商的两性电解重度性较差，其避光4保存。Bio-Lyte两性电解质使用期限为1年。4.3 生物学活性的重复性影响聚焦蛋白质生物学活性的因素如下：在其等电点蛋白质将失活。适当调节pH。蛋白需再特征离子存在下（如 Mg2+、K+）才维持活性。聚焦过程中引起蛋白质变性：温度：酶的活性受温度控制，因此采用致冷系统以保持蛋白质稳定。 溶解试剂：chaotrops、表面活性剂等将增加蛋白质的溶解性，同时也会引起蛋白质变性。适当少量使用此类试剂，并且聚焦分离后应尽快去除试剂。 4.4 分辨率下降IEF分散和多频带性：由于蛋白质自身的分子间作用力、构象变化以及微不均一性引起蛋白质IEF形式的分散和多频带性。同时两性电解质会与蛋白质形成可逆键合作用、蛋白质自身的构象变化、同分异构现象以及蛋白质之间的相互作用都会使分离的分辨率下降。在变性试剂存在下（尿素、表面活性剂、甘油等）对蛋白质样品进行分析型IEF胶分析，可以证实是人为因素还是自身因素引起分辨率的下降。等电点的偏离：其他试剂的使用将影响蛋白质的等电点a. SDS 表面活性剂SDS与蛋白质通过疏水键作用使蛋白质向阳极移动，发生明显的等电点偏移。因此使用非离子型或两性表面活性剂（表6.2）。b. 磷脂、亚铁血红素官能团 蛋白质自身与这类官能团作用产生等电点偏移。采用非离子毛地黄皂苷除去磷脂类化合物，为蛋白质提供疏水环境利于其等电聚焦。c. 蛋白质的自身构造 处于非变性状态下的蛋白质有可能会在非等电点区域发生聚焦。从而在进行Micro Rotofor分离器分离前，进行两性电解质pH范围和分离条件的优化。4.5 电源问题电源使用中出现的普遍现象如下：电压波动：样品和离子交换膜间可能存在气泡，在聚焦分离前将其吸出或重新载样。运行初始阶段电压下降：当带电荷离子在分离腔内运行时，产生很高的起始电流，因此电压会明显下降。随着除盐过程的结束以及pH梯度的形成，聚焦分离开始，当聚焦持续平稳后，电压将有升高趋势，最终达到平稳状态。4.6 收集问题 组份收集过程中产生问题的可能原因如下：收集方法：收集方法不正确将引起不平均体积的收集组份。详见3.6。在收集样品过程中确保聚焦槽上样口全部打开，并确保不破坏取样口的密封带。堵塞或脏的收集针：某些物质会黏附于排针内壁引起针孔的堵塞，导致样品收集出现问题。每次使用后认真清洗排针。 针的松动、弯曲或不等高引起：偶尔针的松动、弯曲或不等高将会使针不能全部穿透密封收集器的密封带，导致收集不均匀。认真核实排针的位置和高度（catalog #170-2851）。渗透因素：随着聚焦分离的进行，Micro Rotofor分离器的聚焦分离腔内将产生不同的渗透压。如果腔体内没有装载足够的样品溶液，将会在10个腔体中产生不同的样品体积。为降低渗透压影响，在分离前每一个分离腔内装载足够体积的样品溶液。真空度过高或过低：使用22-27 Hg真空度聚焦槽发生偏移：核实聚焦槽与收集器平行收集前聚焦槽上样口密封带没有取下：收集样品组份前确认取下了聚焦槽上样口密封带样品缓冲液中高效起泡剂的使用：如使用了高效起泡表面活性剂，如Triton，收集结束后迅速将收集盘移走以防止样品溅射出收集盘。可以使用非起泡表面活性剂：CHAPS 或ABS-14。真空腔垫圈损坏、不平行或丢失：放入收集盘前确认真空腔垫圈的合适位置。4.7 仪器机械问题Micro Rotofor分离器不发生振荡：核实聚焦装置正确放入阴阳极之间核实电源开关处于ON状态以及与电源接口的连接核实电极线圈套管是否旋紧，如果松动，聚焦系统会处于稳定不工作状态。系统泄漏现象： 电解液泄漏： 聚焦装置安装不平行 电极装置安装不恰当 电解液从电极装置中溢出（详见2.3对电极安装的详细过程） 样品泄漏： 样品槽没有用密封带密封 振荡过程中密封带被松动-