SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤(3页).doc

-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤-第 3 页【跑电泳的步骤】1、取出电泳仪器和四个烧杯；2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口；3、配制过硫酸铵溶液（AP）：0.1gAP+0.9g超纯水，保鲜膜封口；4、取出所有药品。Tris-HCL(88,6.8)，TEMED，SDS，Acry-bis，按次序排好；5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪3只；6、先配分离胶7、组装凝胶模具，插好板（1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里；（2）板：Bio-Rad前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。8、配胶见配方， 用2号蓝混匀所有试剂；9、加液至支架上方， 用超纯水液封（不能用气泡）；10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干；11、配浓缩胶；12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我；13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙，装去离子水，不能漏（1h），等待。），样品煮沸3分钟；14、用10uL移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内；15、电压（浓缩胶）90V，电流20mV；16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。【附配方】分离胶 separating gel (5mL) ( 1个板3.5mL)1板2板Prescription12%10%7.5%3.5 mL7.0 mLDel H2O1.6 mL2.3 mL1.3 3mL1.3 mL1.3 mL1.3 mL0.91 mL1.82 mL30%Acry/bis单体胶（+/100mL）2 mL1.7 mL1.3 mL1.38 mL10%SDS50uL50uL50uL35uL70uL10%AP50uL50uL50uL35uL70uLTEMED2uL2uL(5 uL)2uL7uL(夏)8uL浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL)PrescriptionVolume(2 mL)(2 mL)Del H2O250uL375uL30%单体胶330uL495uL10%SDS20uL30uL10%AP20uL30uLTEMED2uL(5 uL)3uL(8 uL冬，5 uL夏)【附所需试剂配制】1、30%单体胶（30%单体胶即30%T，2.67%C） 配制50mL：丙烯酰胺Acry：，甲叉双丙烯酰胺bis：； (100mL：Acry ，bis ) 超纯水定容至50mL，0.45 uM膜过滤，4保存（一个月）；说明：单体浓度%T是指单体总质量（丙烯酰胺+双丙烯酰胺）在溶液中的百分比（m/V），可选择的范围为3%30%；%C是指双丙烯酰胺与单体总质量的比值（m/m），也指交联度。2、分离胶缓冲液配制100mL( Tris-HCL pH8.8)：Tris ，部分去离子水溶解，并用HCL调，最后定容至100 mL，过0.45 uM膜，4保存。3、浓缩胶缓冲液配制50mL( Tris-HCL pH6.8)：Tris ，部分去离子水溶解，并用HCL调，最后定容至50 mL， 4保存。4、10%SDS：5g/50 mL H2O，配制后 4保存。5、10%AP（过硫酸铵）：用时现配，溶解状态十分不稳定，/1mL H2O。.6、电泳缓冲液：配1000 mLTris ，甘氨酸，SDS，去离子水定容至1000 mL。7、染色液： （1）原液：配制200 mL：考马斯亮蓝（R-250）：+200 mL去离子水； （2）染色液：配制500 mL：原液，甲醇250mL，冰乙酸50mL，去离子水mL。8、脱色液：1000 mL甲醇500 mL，冰乙酸100 mL，去离子水定容至1000 mL。9、TEMED原液稳压：Stacking：90V（20mA），Seperate：120V（25mA）。