RT-PCR步骤(4页).doc
-RT-PCR步骤-第 4 页RT-PCR实验步骤1、引物设计2、 RNA提取1)1.5ml 离心管中，取150ul的淋巴细胞，加入1ml Trizol试剂2)静置5分钟 或 马上-70保存4)加入200ul氯仿，振荡混均30秒5)室温静置3-5分钟分层 6)12000rpm离心15分钟，取上清液至新1.5ml管，中间层和红色下层4保存，便于提取DNA和蛋白质7)上清液加入约0.5ml的异丙醇（预冷）,振荡混均30秒，室温下静置15分钟8)12000rpm离心10分钟，弃上清，RNA沉淀管底。9)如沉淀不明显，则再离心数秒吸出上清10)加入1ml 75%乙醇（预冷），温和震荡悬浮沉淀11)8000 rpm离心5 min,弃上清12)短暂快速离心（5秒），吸弃上清13)室温放置2分钟晾干14)沉淀加入15ul DEPC处理水，轻弹管壁溶解15)少量样品55-60孵育1015分钟16)测量ODA260/A280值后，样品放置70保存。(保存时间不应超过一星期)3、 反转录用琼脂糖电泳抽样检测RNA的纯度，如果杂质较多，则需要加DNA酶进行去杂。然后在进行反转录步骤（购买反转录试剂盒）。反转录步骤初步定为： l总RNA，1l随机引物oligo(dt），10lDEPC处理水。2）混匀，瞬时离心5秒。3）70水浴5min。4）迅速冰浴2min。5）瞬时离心，加入4 ul 5× Buffer, 2 ul 0.1M DTT, 2 ul 10Mm dNTPs。6）混匀，温浴2min。7）加入1 ul 反转录酶，42温育50min。8）70孵育10min灭活。9）-70冰箱。4、 PCR条件优化为了寻求PCR最适DNA模版浓度和引物浓度，采用交叉法分别对模版和引物进行梯度稀释，交叉进行PCR反映，确定最佳浓度搭配。(1) 反应体系：SYBR Premix Ex Taq 10ll ROX ReferencellTotal 20l(2) 反应条件Stage 1：预变性 Reps：195，30sStage 2：PCR反应 Reps：4095 5s 60 30s (3) 2块96孔板反应最佳条件，即模板（cDNA）浓度和不同目的基因引物浓度abc1/21/31/41/5HSP70llllllllllllllllHSF1llllllllllllllllNF-KB p65llllllllllllllllGAPDHllllllllllllllllabc1/21/31/41/5c-fosllllllllllllllllBaxllllllllllllllllBcl-2llllllllllllllllGAPDHllll1lllllllllllla：DNA模版浓度（稀释倍数）b：特异性引物浓度c：不同基因A、B、C、D：DNA模版浓度梯度A1、A2、。D3：特异性引物浓度梯度初步设定模版浓度梯度为：2倍、3倍、4倍、5倍（模版的稀释倍数）l（引物出事稀释浓度为10M）5、 PCR反应（1） 以每个384（24*16）孔板同时进行24个样品、7个目的基因PCR，设1个平行组，反应体系及反应条件同步骤4。每列为不同样品，同时测定6个目的基因，1个看家基因，每个设定1个重复，另外48孔可以再测定3个样品，6个目的基因12孔，1个看家基因2孔，每个设定1个重复。最后3孔设置成空白。1234567891011121314151617181920212223241234567 1 2 3 4 5 6 7 a b c d e f g 空 (2) 根据所得曲线作数据分析(3) 取部分PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检验产物的特异性。
