兽医药理学教案第十五章动物毒理学基础.docx

第十五章 动物毒理学根底以科学讨论为目的而进展科学饲养繁殖的动物称为试验动物。试验动物学作为在现代科学带动崛起的一门以生命科学为主体，以医学、生物为核心的综合性独立的新兴学科，正以崭新的相貌，异乎寻常的速度，影响着整个生命科学各领域，成为生命科学讨论的奠基学科和重要支撑条件，因此受到世界各国政府和科学家的重视，甚至作为衡量一个国家生物科学程度凹凸的标记之一。食品毒理学的很多讨论工作须要通过动物试验来进展。运用试验动物进展科研的优点是花费人力、物力较少，时间短，易发觉单因素及结果的关系，能供给大量有价值的可及人类生命活动现象相类比的资料。在毒理学试验讨论中，安康的试验动物是保证工作顺当进展和获得正确牢靠的讨论结果的重要条件。 食品毒理学讨论外源化学物对于机体(特殊是人体)的有害作用及其机制。食品毒理学讨论的主要手段是动物试验。体内试验是以试验动物为模型，最终目的是通过外源化学物对试验动物的毒性反响，向人(原型)外推，以期评估外源化学物对人的危害及危急性。体外试验主要用于挑选和预料急性毒性和机制讨论；人体试验和流行病学调查则可进一步深化和证明在动物试验中所得到的资料。事实上，食品毒理学作为一门试验科学是以动物试验为中心的，食品毒理学动物试验的设计、施行、结果视察和评价是毒理学讨论的根本方法。 食品毒理学试验是对化学物平安性评价的主要手段，已为各国际组织或各国的行政部门所公布的规程或指南列为常规试验，有称为法规毒理学试验( )，这类毒理学试验是以筛查和描绘外来化学物的毒性为目的，属于描绘毒理学范畴。第一节 食品毒理学试验的原则和局限性一、食品毒理学试验的原则在毒理学的试验中，有三个根本的原则。 第一个原则，化学物在试验动物产生的作用，可以外推于人。根本假设为：人是最敏感的动物物种；人和试验动物的生物学过程包括化学物的代谢，及体重(或体外表积)相关。这两个假设也是全部试验生物学和医学的前提。以单位体外表积计算在人产生毒作用的剂量和试验动物通常相近似。而以体重计算则人通常比试验动物敏感，差异可能达倍。因此可以利用平安系数来计算人的相对平安剂量。已知人致癌物都对某种试验动物具有致癌性；试验动物致癌物是否都对人有致癌性，还不清晰，但这已作为动物致癌试验的根底。一般认为，假如某一化学物对几个物种试验动物的毒性是一样的，则人的反响也可能是相像的。 第二个原则是试验动物必需暴露于高剂量，这是发觉对人潜在危害的必需的和牢靠的方法。此原则是根据质反响的概念，随剂量或暴露增加，群体中效应发生率增加。毒理学试验中，一般要设个或个以上剂量组，以视察剂量反响(效应)关系，确定受试化学物引起毒效应及其毒性参数。毒性试验的设计并不是为了证明化学品的平安性，而是为了表征化学品可能产生的毒作用。仅仅检测受试化学物在人的暴露剂量是否引起毒效应是不够的。当引起毒效应的最低剂量()及人的暴露剂量接近时，说明该化学物担心全。当该剂量及人的暴露剂量有很大的间隔 (几十倍，几百倍或以上)，才认为具有确定平安性，此间隔 越大，平安性越牢靠。假如在讨论中所用的一系列的剂量不能引起毒性效应，则认为所用剂量还缺乏够高，应增加剂量，以确定受试化学品的毒性。但假如在试验的最高剂量组的剂量及人可能的暴露剂量有足够的平安界限，则对于平安性评价来说未视察到毒效应的讨论是可以承受的。在毒理学试验中试验模型所需的动物总是远少于处于危急中的人群。为了在少量动物得到有统计学意义的牢靠的结果，须要应用相对较高的剂量，以使效应发生的频率足以检测。例如，低达的癌症发生率，这意味着在万人群中有人发生癌症，此发生率太高，不能为公众承受。在试验动物干脆检测如此低发生率将至少须要只动物。因此，别无选择，在毒理学试验中，对相对较少的试验动物必需以较高剂量进展试验，然后根据毒理学原则外推估计低剂量暴露的危急性。第三个原则，成年的安康(雄性和雌性未孕)试验动物和人可能的暴露途径是根本的选择。选用成年的安康(雄性和雌性未孕)试验动物是为了使试验结果具有代表性和可重复性。以成年的安康(雄性和雌性未孕)试验动物作为一般人群的代表性试验模型，而将幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作为特殊状况另作讨论。这样可降低试验对象的多样性，削减试验误差。毒理学试验结果的敏感性取决于受试物处理引起毒效应强度和试验误差两个因素，处理引起的毒效应强，试验误差小，则试验结果的敏感性增加，反映受试物处理的真实效应，反之亦然。在下文所述的试验设计是要规定试验条件，严格限制可能影响毒效应的各种因素，施行质量保证，降低试验误差。只有这样，才能保证试验结果的准确性和可重复性，不能重复的试验结果是没有任何科学价值的。外源化学物以不同途径染毒，试验动物表现的毒性可有很大差异，这是由于因染毒部位解剖生理特点不同，外源化学物汲取进入血液的速度和量也不同，首先到达的器官和组织也不同。因此，毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人接触该受试物的方式。二、食品毒理学试验的局限性历史上，环境污染物及某些药物所引起的中毒和死亡屡次发生，引起各国的重视，推动了毒理学的开展，各国政府主管部门制订和屡次修订了有关药品和各种化学品平安性评价的标准或准则，盼望在啮齿类和非啮齿类的毒理学讨论能为有关候选新药和各种化学品供给平安性证据，但以动物的资料预料人的毒性的预料价值尚有待于讨论。()和()根据有限的临床资料报告，发觉对人的毒性约一半不能由临床前(动物)毒性讨论预料。()报告个化学物(大多为药品)的靶器官毒性在大鼠和狗(或猴)之间的相符率仅。等()报告种化学物对动物的毒性及人的毒性相符率，啮齿类为，非啮齿类(狗和猴)为，合并达，全部的物种相符率可达。根据目前的标准，进展毒理学平安性评价，可以在确定程度上进步新药和各种化学品的运用平安性，但仍不能完全解除对人安康危害的风险。在临床前药物平安性试验原则的文件中指出“虽然事先对生物活性物质进展了最细致彻底的讨论，但给人运用时总是不行避开地要冒确定的风险。”这就是利用动物试验的局限性，即动物试验的结果外推到人的不确定性。用试验动物的毒理学试验资料外推到人群接触的平安性时，会有很大的不确定性。这是因为，外源化学物的毒性作用受到很多因素的影响。首先，试验动物和人对外源化学物的反响敏感性不同，有时甚至存在着质的差异。虽然在毒理学试验中通过用两种或两种以上的动物，并尽可能选择及人对毒物反响相像的动物，但要完全避开物种差异是不行能的。而且，试验动物不能述说涉及主观感觉的毒效应，如难受、腹胀、疲惫、头晕、眼花、耳鸣等，这些毒效应就难以或不行能发觉。在动物试验中，可视察到体征()，而没有病症()。第二，在毒理学试验中，为了寻求毒作用的靶器官，并能在相对少量的动物上就能得到剂量反响或剂量效应关系，往往选用较大的染毒剂量，这一剂量通常要比人实际接触的剂量大得多。有些化学物在高剂量和低剂量的毒性作用规律并不确定一样，如大剂量下出现的反响有可能是由于化学物在体内超过了机体的代谢实力，这就存在高剂量向低剂量外推的不确定性。第三，毒理学试验所用动物数量有限，那些发生率很低的毒性反响，在少量动物中难以发觉。而化学物一旦进入市场，接触人群往往会很大。这就存在小数量试验动物到大量人群外推的不确定性。第四，试验动物一般都是试验室培育的品系，一般选用成年安康动物，反响较单一，而接触人群可以是不同的人种、种族，而且包括年老体弱及患病的个体，在对外源化学物毒性反响的易感性上存在很大差异。以上这些都构成了从毒理学动物试验结果向人群平安性评价外推时的不确定因素。第二节 毒理学毒性评价试验的根本目的 毒理学试验的常规部分是毒性评价或平安性评价试验。为了对受试物的毒性进展全面的测试，增加测试结果的牢靠性，权威机构规定了评价程序，以保证毒性评价讨论可以到达普遍能承受的最低要求和原则。毒理学家认为毒理学试验程序应当有确定的敏捷性。对毒理学试验的原理和设计思路的深化理解，有助于讨论者对评价程序的施行，在发觉新的现象或线索时，可进展一些补充试验来证明，并可进一步讨论其机制。 毒性评价或平安性评价方面的根本目的包括以下几点： . 受试物毒作用的表现和性质。在急性和慢性毒性试验中，视察受试物对机体的有害作用，对有害作用的视察应当是对每个试验动物进展全面的逐项的视察和记录。发觉有害作用是进展剂量反响(效应)讨论的前提。 . 剂量反响(效应)讨论。剂量反响(效应)讨论是毒性评价和平安性评价的根底。通过对不同有害作用的剂量反响(效应)讨论，可以得到该受试物的多种毒性参数。在急性(致死性)毒性试验中，应当得到，也可以得到和。在急性非致死性毒性试验中，应当得到急性可视察到有害作用的最低剂量()和未视察到有害作用的剂量()。在亚急性、亚慢性及慢性毒性试验中，应当得到相应的和。在致突变、致癌和致畸等特殊毒性试验中，剂量反响(效应)讨论将为确定受试物是否具有这些特殊毒性供给根据。在致畸试验也可得到和；在致突变、致癌试验中，尽管认为是无阈值的，但也可得到表观的和。. 确定毒作用的靶器官。确定受试物有害作用的靶器官，是毒理学讨论的重要目的，以说明受试物毒作用的特点，并为进一步的机制讨论和毒性防治供给线索。. 确定损害的可逆性。一旦确认有害作用存在，就应讨论停顿接触后该损害是否可逆和消逝，器官和组织功能是否能复原，还是像化学致癌作用那样停顿接触后损害接着开展? 毒性的可逆性关系到对人的危害评价，假如受损的器官组织可以修复并复原正常功能，则可能承受较高危急性的接触程度。 当然，毒理学讨论还可能有其他的目的和要求，例如毒作用的敏感检测指标和生物学标记、毒作用机制讨论、受试物的毒物动力学和代谢讨论、中毒的挽救措施等。对这些要求，应扩展常规试验的设计以包括有关的工程，或者另外设计和进展靶器官毒理学讨论及机制毒理学讨论。第三节 试验动物的选择和处理毒理学的动物试验是以试验动物作为讨论对象的，为获得牢靠的讨论结果，先决条件是正确地选用试验动物。一、试验动物物种的选择 外源化学物的固有毒性往往在人和不同物种试验动物之间表现不同，物种差异可以表如今量方面，引起毒性的剂量差异，即毒性大小的差异，如有报道，对人种化学物的敏感性为大鼠的倍。物种差异也可以表如今质方面(毒性效应的差异)，如除草剂百草枯(对草快)对人引起肺损伤，而对狗则未见到。因此，须要对试验动物物种进展选择。物种间毒性反响差异的缘由，可能归纳为解剖及生理学差异，遗传及代谢的差异等。 对试验动物物种选择的根本原则是：选择对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征及人最接近的物种；自然寿命不太长的物种；易于饲养和试验操作的物种；经济并易于获得的物种。在选择试验动物时存在固有的限制。可利用的物种不多，主要缘由包括经济(购置和饲养的费用)、试验动物的寿命、行为和生活实力、处置，或许最重要的是对该物种“正常”生理和病理的资料，以及对所讨论的毒性的敏感性。要利用对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征及人最接近的物种，这就须要理解试验动物物种和人对受试化学物的汲取、生物转化等资料，但这往往并不切合实际，因为首先须要进展一系列的比拟讨论，而对人体的资料在动物试验之前是很难得到的。在毒理学讨论中常用的试验动物物种如下：大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的试验动物有地鼠、猕猴、小型猪、鸡等。其中，大鼠、小鼠、豚鼠和地鼠为啮齿目动物。常用试验动物生物学和生理学参数见表。以上所述毒理学试验常用的试验动物各物种中，事实上没有一种完全符合上述物种选择的原则，目前常规选择物种的方式是利用两个物种，一种是啮齿类，另一种是非啮齿类。系统毒性讨论最常用的啮齿类是大鼠和小鼠，非啮齿类是狗。豚鼠常用于皮肤刺激试验和致敏试验，兔常用于皮肤刺激试验和眼刺激试验。遗传毒理学试验多用小鼠，致癌试验常用大鼠和小鼠，致畸试验常用大鼠、小鼠和兔。迟发性神经毒性试验常用母鸡。一般假设，如以及人一样的接触方式、大致一样的剂量程度，在两个物种有毒性反响，则人有可能以一样的方式发生毒性反响。当不同物种的毒性反响有很大的差异时，必需讨论外源化学物在不同物种的代谢、动力学及毒作用机制，然后才可将试验结果外推到人。表 常用试验动物生物学和生理学参数参 数猴狗猫兔大 鼠小 鼠豚 鼠地 鼠成体体重()寿命()水消耗()饲料消耗 (本钱)成体代谢( )体温()39l38l呼吸频率(次)()()()()()()()()心率(次)血压 (收缩舒张)诞生体重()断乳时体重()开眼()诞生当天诞生当天妊娠()性周期()动情期()窝数量断乳年龄(周)生殖年龄(月)生殖期(年)生殖季节任何时间春，秋冬季个月任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间所需面积()*环境温度()血容量( )凝血时间()(红细胞)()*所需面积()，及为英尺，1ft30.48cm引自：参考书，二、试验动物品系的选择品系()是试验动物学的专用名词，指用支配交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。试验动物按遗传学限制分类可分为：近交系：指全同胞兄妹或亲子之间连续交配代以上而培育的纯品系动物。如小鼠有津白、津白、，和，和等。杂交群动物(杂交代，)，指两个不同的近交系之间有目的进展交配，所产生的第一代动物。封闭群：一个种群在五年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。如昆明种小鼠、小鼠、小鼠、大鼠、大鼠、()大鼠等。 根据试验动物遗传的均一性排序，近交系最高、杂交群次之、封闭群较低。不同品系试验动物对外源化学物毒性反响有差异，所以毒理学讨论要选择相宜的品系，对某种外源化学物毒理学系列讨论中应固定运用同一品系动物，以求讨论结果的稳定性。 遗传毒理学一般利用啮齿类动物，主要是小鼠或大鼠。假如有适宜的理由，其他物种也可承受。有的文献报告在小鼠骨髓微核试验品系比，或品系更敏感。但一般认为还没能证明某一品系对全部的遗传毒性物质比其他品系都敏感。在致癌试验中对试验动物的品系有确定的要求，特殊重视有关病理损害的自发发生率。例如，某些大鼠品系垂体肿瘤发生率高，则不适用于靶器官为内分泌系统的毒性讨论。又如雄小鼠肝肿瘤高发生率可能有碍于肝致癌反响的检测。三、对试验动物微生物限制的选择 按微生物限制分类，试验动物分为四级，见表。对于毒性试验及毒理学讨论应尽可能运用二级(或二级以上)的动物，以保证明验结果的牢靠性。表 试验动物微生物等级级 别要 求 级 级 级 级一般动物，应没有传染给人的疾病 清洁动物，除级标准外，种系清晰，没有该动物特有的疾病 无特定病原体动物()，除级标准外，动物为剖腹产或子宫切除产、按纯系要求繁殖，在隔离器内或层流室内饲养，可有不致病细菌丛，没有致病病原体 无菌动物，在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，动物体外不带有任何微生物和寄生虫(包括绝大部分病毒)四、个体选择 试验动物对外来化学物的毒性反响还存在个体差异，应留意试验动物的个体选择。 . 性别 同一物种、同一品系的试验动物雌雄两性通常对一样外源化学物毒性反响类似但雌雄两性对化学物的毒性敏感性上存在着差异。有文献报道在种外源化学物中雌雄敏感性比值小鼠平均为，大鼠为，这种差异表如今试验动物性发育成熟开场，直至老年期。可见雌雄两性动物的性激素性质和程度是关键因素，一般讲雄性动物体内微粒体细胞色素酶系活性大于雌性动物，所以经该酶系降解解毒的外源化学物对雌性动物表现的毒性大，然而经该酶活化增毒的外源化学物却相反。 假如已知不同性别的动物对受试物敏感性不同，应选择敏感的性别。如对性别差异不清晰，则应选用雌雄两种性别。照试验中发觉存在性别差异，则应将不同性别动物的试验结果分别统计分析。 在遗传毒理学体内试验中，对性别的选择有几种意见： () 对单个物种应用两种性别。 () 对单个物种应用两种性别，除非已在一特性别得到阳性反响，就不必对另一种性别进展试验。 () 对单个物种应用两种性别，除非经毒代动力学讨论证明受试物(和其代谢产物)在雄性和雌性无差异和或假如在确定剂量的预试验证明有相等毒性。此假定在非遗传毒性及遗传毒性之间有相关。 () 对单个物种常规用一种性别(雄性或雌性)，除非预期证明存在性别差异。由于历史的缘由体内体外试验常规用雄性大鼠。 一般来说，对于初次试验的受试物，应当采纳两种性别。对大鼠和小鼠各一种性别进展试验可能比单个物种两种性别供给更好的危害鉴定，但这须要更多的资料来证明。 . 年龄和体重 试验动物同人类一样，生命全程大体上可区分三个阶段，即幼年期(从诞生到性成熟之前)、成年期和老年期。在成年期，各种激素(包括性激素)、代谢酶都处于顶峰稳定期，并对外源化学物的毒性反响差异较小，且有代表性。在幼年期和老年期，对外源化学物的生物转运和生物转化，靶器官和受体的敏感性均及成年期不同。如有报道外源化学物对成年动物的致死剂量(或)及新生动物比拟，其比值在之间，说明有的外源化学物对新生动物毒性低，也有的毒性反响强。毒理学试验选用试验动物的年龄取决于试验的类型。急性试验一般选用成年动物;慢性试验因试验周期长，应选用较年幼的或初断乳的动物，以使试验周期能复盖成年期。试验动物的年龄应由其诞生日期来定，但实际工作中常以动物的体重粗略地推断动物的年龄，作为选择适龄动物的根据。同一试验中，组内个体间体重差异应小于，各组间平均体重差异不应超过。 . 生理状态 在毒理学试验中动物如出现妊娠，则影响体重及其他指标的检测结果，并且，性激素对外源化学物代谢转化有影响，故应选用未产未孕的雌性动物。雌雄动物应分笼饲养。但在某些试验如显性致死试验、致畸试验及繁殖试验等，则需有支配地合笼交配。 . 安康状况 试验动物的安康状态对毒理学试验结果有很大的影响，因此应选用安康动物。对于试验动物微生物限制的选择事实上是选择安康状况的一个重要指标，安康个体的选择还包括了其他方面。安康动物应发育正常、体形强健，无外观畸形，被毛浓密、有光泽、顺贴而不蓬乱，行动敏捷、反响灵敏，眼睛光明有神，表皮无溃疡和结痴，自然孔道干净无分泌物等。 为确保选择安康动物，一般在试验前视察天。对于大鼠和狗的亚慢性和慢性试验，可在试验前采血进展血液学和血液生化学检查，异样的动物应剔除；对狗应常规驱除肠道寄生虫。 合理的全养分饲料对维持试验动物安康和正常的生理活动是至关重要的。高温及低温时外源化学物的毒性一般比常温为高。气温上升而毒性增大，这种毒性变更可能是由于温度影响了毒物动力学所致。高温、高湿环境共存时皮肤更易于外源化学物经皮肤汲取。 人工昼夜周期，即使动物处于人工调控的小时白昼(早点至晚点)及小时黑夜(晚点至次日早点)，以稳定其生物时间节律。在正常、安康的动物每天小时的生理规律不尽一样，即存在着生物时间节律，对外源化学物的毒性反响也有昼夜性时间变更，因此出现毒理学新的分支学科，称为时间毒理学()。由于动物存在时间节律，外源化学物在不同时辰表现的毒性反响有差异，所以在毒理学实际工作中，尤其是进展亚慢性和慢性染毒时，每日的染毒时间应固定一样，以防止出现时间毒性的影响。而且实行动物生物样品(如血、尿等)进展各种指标的化验或一些生理功能的检查(如血压、体温等)也应固定时间。 根据我国的法规和有关规定，国家实行试验动物的质量监视和质量合格证制度。试验动物的保种、饲育、供给和应用单位，由各级医学动物管理委员会进展定期监视、监测，并颁发试验动物和试验设施的合格证书(有效期年)。应用的试验动物必需有完好的资料。进展动物试验的人员应经培训，获得资格认可(上岗证)。试验动物的饲养设施、环境条件及饲料等必需符合有关的国家标准。第四节 食品毒理学试验设计要点一、体内毒理学试验设计 . 剂量分组 在毒理学试验中，最重要的就是讨论剂量反响(效应)关系，也就是当外源化学物染毒剂量增加，试验动物的毒性反响(效应)随之而增加。剂量反响(效应)关系的存在是确定外源化学物及有害作用的因果关系的重要根据，也可证明试验结果的牢靠性。因此，在毒理学试验中，一般至少要设个剂量组(即高剂量组、中剂量组、低剂量组)，盼望能得到满足的剂量反响(效应)关系。 一般要求，高剂量组应出现明确的有害作用，或者高剂量组剂量已到达染毒的极限剂量(如大鼠或小鼠灌胃或注射的最大容量)。低剂量组应不出现任何可视察到的有害作用(即相当于)，但低剂量组剂量应当高于人可能的接触剂量，至少等于人可能的接触剂量。中剂量组的剂量介于高剂量组和低剂量组之间，应出现稍微的毒性效应(即相当于)。高、中、低剂量组剂量一般按等比例计算，剂量间距应为或，低剂量组剂量一般为高剂量组剂量的。 急性毒性试验分组和剂量选择见下一章。亚慢性毒性试验的高剂量应当用急性毒性的的某个分数或。在长期或致癌试验，最高剂量选择为由亚慢性毒性试验确定的最大耐受剂量()，毒动学或代谢资料可能有助于确定剂量，特殊是有受试物或其代谢产物的蓄积或有剂量依靠性解毒变更的证据。有人认为，在新药平安性评价中，试验期限等于或小于天，限度剂量为(·)；如大于天限度剂量为(、)。在无毒性状况下，对限度剂量的例外是基于该途径的最大染毒容量。 毒理学试验常用的比照有种： () 未处理比照组(以前有称为空白比照组)：即比照组不施加任何处理因素，不给受试物也不给以相应的操作。未处理比照组往往用于遗传毒理学试验中，确定指示生物的生物学特征的本底值，进展质量限制。 () 阴性(溶剂赋形剂)比照：不给处理因素但给以必需的试验因素(溶剂赋形剂)，以解除此试验因素(溶剂赋形剂)的影响，阴性比照作为及染毒组比拟的根底。没有阴性比照组就不能说明受试物染毒及有害作用之间的关系。例如，在试验中，染毒各剂量组试验动物出现某些异样、甚至死亡；假如阴性比照组没有发觉异样，我们可以认为此种异样和死亡是由于受试物的毒作用；假如阴性比照组也出现同样的异样和死亡，则应考虑是由于试验动物患某种传染病或其他非试验因素所致，必需重新进展试验。 () 阳性比照：用已知的阳性物(如致突变物)检测试验体系的有效性。阳性比照组最好及受试物用一样的溶剂、染毒途径及采样时间。在遗传毒理学试验、致畸试验和致癌试验中都运用了阳性比照组，阳性比照组是用已知的致突变物、致畸物或致癌物染毒，应当得到确定的阳性结果(即致突变性、致畸性或致癌性)。这是由于这些试验，特殊是遗传毒理学试验的变异较大，为了进展质量限制而设置阳性比照组。当同时进展的阴性(溶剂赋形剂)比照组不能得到阴性结果，阳性比照组不能得到阳性结果，说明此次试验质量有问题，全部数据无效，必需重新试验。在遗传毒理学试验中，阳性比照及受试物应当用同样的途径和溶剂赋形剂，但如有困难，则不同的染毒途径、不同溶剂赋形剂也可以承受。 () 历史性比照：由本试验室过去屡次试验的比照组数据组成，上述三种比照都可构成相应的历史比照。历史比照的最好用处是通过同质性检验检查试验体系的稳定性，即进展试验室质量限制和保证。由于试验毒理学的各种参数至今尚没有公认的参考值，因此历史性比照均值及其范围在评价讨论结果时至为重要。 以上所述适用于大多数的毒理学体内试验。在急性毒性试验测定或时，剂量组数根据选用的设计和统计学方法而定，可以是组，也可以是组。根据预试验结果，盼望所设计的中间剂量组的剂量及最终得到的()接近。由于急性毒性试验的视察指标是死亡，并伴有严峻的中毒病症，对于有阅历的试验者可以不设阴性比照组。当然，假如运用了一种不常用的溶剂或者要测定某种其他的参数如、急性和，则须要设置阴性比照组。 . 各组动物数 毒理学平安性评价试验各组动物数取决于很多因素，照试验目的和设计，要求的敏感度、试验动物的寿命、生殖实力，经济的考虑及动物的可利用性。各组动物数的设计应考虑到统计学的要求。对各种常规毒性试验的动物数要求，见以后有关章节。 . 试验期限 某些试验(如致畸试验和多代生殖试验)的试验期限是由受试试验动物物种或品系而确定的。而其他毒性试验的期限在某种程度上由定义所确定。如急性毒性是一次或天内屡次染毒视察天，亚慢性毒性试验规定为染毒持续至试验动物寿命的，对大鼠和小鼠为天，对狗应为年。慢性毒性试验致癌试验一般规定为持续至试验动物寿命的大部分。又可分为两类，即规定试验期限的试验，或直到最敏感的组死亡率到达某一程度(通常为)的试验。二、体外毒理学试验设计 此处简要讨论在遗传毒理学体外试验共同考虑的几个问题。 测定受试物溶解性 应当测定受试物在试验介质中的溶解性。已留意到在试验系统暴露期内，受试物的溶解性可能变更，因为存在细胞、血清等。因此，在试验开场和完毕时评价溶解性是有意义的。溶解性限度就是出现沉淀的最低浓度。 试验最高剂量的举荐 对可溶性受试物浓度高于时可因高浸透压在哺乳动物细胞引起损伤或人工假象，对细菌则无此影响。由于受试物的分子量并不确定知道(如聚合物或混合物)，因此，在大多数状况下，可溶性受试物的试验上限应当是：()对哺乳动物细胞为或。()对细菌试验为平板。当受试物供给困难或特别昂贵(如生物药剂)，最高剂量低于或(或平扳)是可以承受的。对不溶性受试物最高浓度的举荐有争辩，日本学者的资料说明，有的受试物仅在沉淀剂量于细菌试验和染色体畸变试验中出现遗传毒性。哺乳动物细胞具有吞噬作用，细菌不具有吞噬作用。一般认为无毒性的可溶于适当的溶剂而不溶于试验培育液(介质)中的受试物，最高浓度应是溶解性限制(即产生沉淀的最低浓度)，但不应干扰终点的计数。 对于有毒性的受试物，最高浓度在细菌试验中应当是明显显示毒性的剂量，对哺乳动物细胞试验最高剂量，基因突变试验应到达存活率，而染色体畸变和试验应到达存活率。 对于没有适当溶剂，完全不溶的受试物，则可以按平板或()进展试验以检测杂质的致突变性。或者，采纳生理盐水提取物进展试验。 . 代谢活化 代谢活化常规运用 （多氯联苯）预处理的雄性成年大鼠肝匀浆离心上清液()，及相应的辅因子(再生系统)。由于各国禁用限用多氯联苯，可用苯巴比妥和萘黄酮结合诱导制备(，)。对体外哺乳动物细胞试验，还可利用大鼠肝原代培育细胞等作为代谢活化系统。 . 阳性比照 阳性比照的剂量应选择其剂量反响的直线部分，并且构成历史性资料(历史性比照)，并以其作为试验质量限制的措施之一. 重复 由质控良好的试验得到明确的阴性结果和阳性结果，不强调要求重复。可疑结果则应重复试验，最好变更剂量范围剂量间隔、变更浓度或变更试验方法进展重复。 第五节 试验动物的柒毒和处置本节简要介绍在动物试验前的试验动物打算、受试物的打算、染毒途径和方法、动物处死和生物标本采集的根本内容，具体的方法和步骤请查阅有关的毒理学试验方法专著。一、动物试验前的打算 试验动物在购进之后，应雌雄分开饲养。一般应进展天的检疫，在此期间应屡次视察动物，刚好剔除不安康的动物。视察期完毕，将试验动物按试验设计的要求进展标记和分组。 试验动物的标记方法对啮齿动物常用染色法，可用苦味酸(黄色)、品红(红色)的酒精饱和溶液在动物被毛上染色，不同的颜色和染色部位表示不同的编号，可标出号。由于被毛上颜色会逐步消逝，故需重复染色。对啮齿动物还可用剪耳法标记。对狗等大动物一般用挂牌法。试验动物分组的原则要求全部的动物安排到各剂量组和比照组的时机均等，避开主观选择倾向，削减偏性，以保证结果的准确牢靠。正确的分组方法是随机分组。试验动物按性别、体重依次编号，然后利用统计学的随机数字表，按完全随机分组法或配伍组随机分组法，将试验动物安排到各剂量组和比照组。然后应计算各组试验动物体重的均值和标准差，必要时可将试验动物适当调组，以使各组试验动物体重的均值的差异不超过允许范围。二、受试物和样品的打算 应理解受试物的纯度及杂质成分，理解受试物的化学构造和理化性质，特殊是其挥发性和溶解性。查阅文献，检索及受试物化学构造和理化性质相像的化合物的毒性资料，以作参考。对各个毒理学试验应当用同一种、同一批号受试物。受试物成分和配方必需固定。如是异构体混合物，异构体比例必需固定。活性成分的百分含量和可检测的杂质的浓度也应固定。受试物在贮存期内稳定性和在饲料中的稳定性必需进展讨论并报告。受试物应一次备齐全部试验的用量。 所需受试物总量(×××)× 式中：为每组动物数；为各处理组的剂量和(如)；为染毒次数(通常为天)；为动物的平均体重；为平安因子，防止损耗。 染毒前根据染毒途径的不同，应将受试物制备成确定的剂型。常用的是制备成水溶液、油溶液或混悬液。对溶剂和助溶剂的要求是，所用的溶剂或助溶剂应当是无毒的，及受试物不起反响，受试物在溶液中应稳定。对水溶性受试物，体内试验适当的溶剂为水(经口染毒)和等渗盐水(胃肠道外染毒)。水不溶性受试物应溶于或悬浮于适当的有机溶剂中。自然植物油(如玉米油，橄榄油)可以用作为溶剂，有两个缺点，即不行能保证得到成分完全一样的植物油，植物油中的抗氧化剂成分等可影响受试物的毒性遗传毒性。二甲基亚矾()不适用于体内试验，因其毒性较高，并且溶于的受试物在染毒后出现沉淀。新药平安性评价举荐混悬液赋形剂为羧甲基纤维素钠或阿拉伯树胶；受试物溶液应簇新配制，除非已证明贮存稳定。其他的剂型见下文染毒途径的介绍。 外源化学物用溶剂稀释，一般讲浓溶液比稀溶液毒性大，但是也有的外源化学物稀释之后毒性反而增加，即存在所谓“稀释毒性”，其缘由尚不清晰。 在打算染毒制剂时的要点：在打算制剂时加热受试物不应接近变更其化学性质或物理性质的温度。如受试物为固体，并且评价其对皮肤的毒性，应保持其形态和颗粒大小。多成分的受试物(混合物)应按配方配制，以使染毒制剂准确地反映原混合物(即其成分不应被选择性地悬浮或溶解)。制剂应保持化学稳定性和受试物的一样性。制剂应削减总试验容积，利用溶剂或赋形剂的量不应过多。制剂应易于准确染毒。如可能，制剂应为。不应用酸或碱使受试物解离(基于爱护动物的缘由，并避开变更肠道或肾小管内的)。假如应用非胃肠道途径，终溶液应尽可能接近等渗。 对于各种染毒途径的最大容积，以受试的试验动物物种或制剂来确定。一般规定，染毒最大容积为：经口(对空腹动物);经皮(根据体外表积计算，限于染毒的准确性)；静脉(分钟以上)；肌肉注射(一个部位)；每眼;直肠；阴道：大鼠，兔；吸人；鼻：猴或狗每鼻孔。染毒的通常容积(最大容积)：大鼠灌胃为()体重()，静注为() ;小鼠灌胃为() ，静注为() ；狗灌胃为() ，静注为() 。各种标准可能有不同的规定，应按规定进展。三、染毒途径毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人在接触该受试物的方式。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。不同途径的汲取速率，一般是：静脉注射吸入肌肉注射腹腔注射皮下注射经口皮内注射其他途径(如经皮等)。 . 经口(胃肠道)染毒 常用有灌胃、喂饲和吞咽胶囊等方式。 () 灌胃：将受试物配制成溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内。一般灌胃深度从口至剑突下，最好是利用等容量灌胃法，即受试物配制成不同浓度，试验动物单位体重的灌胃容量一样。大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食小时(因小鼠消化汲取和代谢速度较快)，均不停饮水。灌胃后小时供给饲料。经口屡次染毒，一般不禁食，但应每日定时染毒。灌胃法优点是剂量准确，缺点是工作量大，并有伤及食道或误入气管的可能。 () 吞咽胶囊：将确定剂量的受试物装入胶囊中，放至狗的舌后部，迫使动物咽下，此法剂量准确，适用于易挥发、易水解和有异味的受试物。 () 喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供试验动物自行摄入。饲料中掺入受试物不应超过，以免造成饲料养分成分变更而影响试验动物的生长发育。喂饲法符合人类接触受试物的实际状况，但缺点多，如适口性差的受试物，试验动物拒食；易挥发或易水解的受试物不适用。而且，试验动物应单笼喂饲，以食物消耗量计算其实际染毒剂量。 . 经呼吸道染毒 经呼吸道染毒可分为吸入染毒和气管内注入。 () 静式吸入染毒：将确定数量的啮齿类动物放在密闭的染毒柜中，参加易挥发的液态受试物或气态受试物使成确定浓度。一般升的染毒柜接触小时，可放小鼠只或大鼠只。静式吸入染毒简易，但缺点较多，主要是随试验进展氧分压降低(因此，试验动物数量有限制)，柜内受试物浓度也渐渐下降(由于动物吸入消耗、为被毛及染毒柜壁吸附所致)，而且试验动物有经皮汲取的可能。 静式吸入染毒多以计算方法得到染毒柜内受试物浓度，以表示。 () 动式吸入染毒：由染毒柜、机械通风系统和配气系统三部分构成。对设备的要求较高，优点是在染毒过程中染毒柜内氧分压及受试物浓度较稳定，缺点是消耗受试物的量大，并易于污染环境。动式吸入染毒又分为整体接触和口鼻接触两种。 动式吸入染毒柜中受试物的浓度应实际监测。 () 气管内注入：试验动物在麻醉后，将受试物注入气管，使之分布至两肺。此法用于建立急性中毒模型及尘肺讨论。 . 经皮肤染毒 经皮肤染毒的目的有两种。一种是经皮染毒毒性试验，如经皮测定常用大鼠，皮肤致癌试验常用小鼠。另一种是皮肤刺激和致敏试验，皮肤刺激试验常用兔和豚鼠，皮肤致敏试验用豚鼠。 试验前用机械法(剃毛)或化学法(硫化钠或硫化钡)脱毛。要求是不应损伤脱毛区的表皮，脱毛区面积不大于动物体外表积的。于脱毛后小时涂抹确定量受试物，盖上一层塑料薄膜，再用无刺激性的胶布固定，接触规定的时间。 . 注射染毒 注射用药品，应以注射途径染毒，对大小鼠可用静脉注射，对非啮齿类可模拟临床用药途径，如狗可用后