暨南大学动物细胞工程复习题含复习资料.docx

1.体外培育的细胞按生长方式可分为哪二种? 按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型? 按生长方式分为二型： 粘附型细胞:附着在某一固相支持物外表才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物外表，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。）可分四型：(1)上皮型细胞 (2)成纤维型细胞 (3)游走型细胞 (4)多形型细胞2.简述体外培育细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程通常，体外培育细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段：原代培育期：也称初代培育，是指从机体中取出细胞接种培育到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活泼挪动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培育阶段的细胞及体内原组织在形态构造和功能活动上有很大的相像性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的互相依存性强，在软琼脂培育基培育时细胞集落形成率很低。传代期 ：通常是培育细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培育的细胞经传代后常被称做细胞系。一般状况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的实力就会渐渐减弱，甚至完全丢失，细胞便进入衰退期。衰退期：处于衰退期的培育细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最终衰退死亡。以上特点，主要是针对体外培育的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得长久性的增殖实力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。每代贴附生长细胞的生长过程：游离期：细胞接种后在培育液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时间：10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期完毕。底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等潜藏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜藏期一般为624小时。对数生长期：细胞数随时间变更成倍增长，活力最佳，最合适进展试验探讨。停顿期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度限制3.简述体外培育细胞对生存环境的根本要求.细胞的养分须要：根本养分物质：氨基酸（种谷氨酰胺）、维生素、葡萄糖、核糖、脱氧核糖等无机离子。促细胞生长因子：多由血清供给细胞的生存环境：温度条件对细胞生长的影响：不同生物来源的组织细胞培育温度不同；体外培育动物细胞最常用的温度是37，耐低温不耐高温。在生理温度范围内，温度及细胞生长率之间存在正相关关系。 气相环境对细胞生长的影响：动物细胞培育的气相环境都是采纳5%CO2及95%空气（供给氧）的混合气体。2参及细胞的能量代谢过程，2用于维持培育液的酸碱度，一般多为开放式培育 培育液的酸碱度对细胞生长的影响：大多数的有机体细胞能在pH6.08.0的环境中生存。最相宜的pH值范围是7.27.4。体外培育的正常细胞耐酸实力要强于耐碱实力无污染、无毒。4什么是细胞培育用液,主要分为哪几类?培育用液是维护组织细胞生存、生长及进展细胞培育各项操作过程中所需的根本溶液。主要包括：平衡盐溶液 ； 培育基； 其他培育用液 。5D-Hanks及Hanks的主要区分是什么?D-Hanks不含有Ca2+、Mg2+ ，常用于配制胰酶溶液。6简述胰酶的常用浓度及配制时的留意事项。胰酶(trypsin)溶液： 浓度一般为0.10.25，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液 。7.细胞培育中血清的主要作用？ (1)供给根本养分物质 ； (2)供给贴壁和扩展因子 (3)供给激素及各种生长因子； (4)供给结合蛋白 (5)对培育中的细胞供给某些爱护作用 8.血清的运用及储存有哪些留意事项？（1）运用前的处理：运用前通常在56加热30分钟，这一过程称为灭活。热灭活目的：灭活血清中的补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清可以考虑不经灭活干脆用于细胞培育。（2）储存条件：血清一般储存于20,同时应避开反复冻融 。大包装的血清，首先将血清灭活处理，然后分装为小包装，如10ml、20ml、50ml，储存于-20，运用前溶化。溶化后的血清在4不宜长时间存放，应尽快运用。9.简述干粉培育基的配制过程。DMEM培育液的配制（举例）： 900 mL ddH2O于1000 mL烧杯中，将DMEM粉1包倒入其中，盛粉袋用50 mL ddH2O分次冲洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）搅拌溶解。用510的NaHCO3调pH至7.2。加青、链霉素至终浓度100u/mL 和100ug/mL 用0.22um的滤膜过滤除菌。分装（200 mL左右）后4冰箱保存。 10.细胞培育工作室可分为那几个局部，各有什么作用?一般包括：打算室、培育室和缓冲室。作用：打算室：用于进展培育器皿的清洗、包装、培育物质的打算和消毒以及供给物品的保藏等。培育室：用于进展细胞培育和各种无菌操作的试验室。其根本条件是：清洁、无菌、枯燥、不通风，并具有相宜的光线。天花板不宜高过2.5M。缓冲室：（更衣室）11. CO2培育箱的作用及运用中的留意事项。用于维持适当温度、湿度及pH。留意事项：质量关键在控温装置，温度变更一般不应超过0.5度;培育箱的温度设在3537，这是人和哺乳动物培育细胞的最适温度。培育容器需及外界保持通气状态。箱内空气应保持干净，定期消毒（紫外灯、酒精）水槽:保持肯定湿度12. 试述清洁液的配方组成及配制时的留意事项。清洁液 :重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml），强清洁液 631000200 ，次强清洗液 120 2001000 ，弱清洁液 100 1001000配制时应留意平安，须穿戴耐酸手套和围裙，并要爱护好面部及身体袒露局部。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后渐渐加浓硫酸，并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色13简述消毒灭菌的常用方法、要求条件及主要应用范围。物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台外表和不能运用其它法进展消毒的培育器皿。消毒时间：30min（至少）； 紫外杀菌功能除了紫外本身以外，还可以由产生的臭氧来完成。紫外灭菌以后，最好过一个小时再进去。过滤：0.22m（适用于液体）湿热（高压蒸气灭菌法）15磅,121，20min各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下： 培育用液、橡胶制品 l0磅l0分钟 布类、玻璃制品、金属器械等 15磅20分钟干烤：160, 2 小时（适用于玻璃器皿等）留意：消毒后不要马上翻开箱门，以防冷空气隧然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。化学消毒灭菌法：7%酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台外表及无菌室内的壁面处理。1新洁尔灭 主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。抗生素 主要用于培育用液灭菌或预防培育物污染。细胞培育中最常用的抗生素是青霉素（常用浓度是100u/ml）及链霉素（100g/ml）。不要在原代培育中参加抗生素 。14. 如何对玻璃器皿进展有效清洗？玻璃器皿的清洗：浸泡刷洗(+烘干)浸酸冲洗；清洗后的玻璃器皿：干净透亮无油迹。浸泡： 初次运用和培育运用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。新的初次运用的玻璃器皿，在消费及运输过程中，玻璃外表带有大量的干固的灰尘，且玻璃外表常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。先用自来水简洁刷洗，然后用5稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次运用的玻璃器皿则常附有大量刚运用过的残留蛋白质，干固后不易洗掉，用后马上浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。刷洗：用毛刷（特制的羊毛刷）沾洗涤剂刷洗，以除去器皿外表附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿外表光泽度。自然晾干或烘干后泡酸。浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液（洗液）中。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。浸泡时器皿要充溢清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时。冲洗：在运用后，刷洗及浸泡后都必需用水充分冲洗,使之尽量不留污染或清洁液的残迹。最好用洗涤装置。如用手工操作，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，然后用蒸馏水清洗3-5 次，晾干（或烘干）备用15细胞培育中最常用的抗生素及运用浓度是什么?青霉素（常用浓度是100u/ml）及链霉素（100g/ml）。16什么是原代培育？简述原代培育方法的分类及主要操作步骤。原代培育：取自体内簇新组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称原代培育。原代培育方法分类：贴块法和消化法。消化法又分为冷消化及热消化；一次性消化及分次消化。主要步骤：贴块法：将获得洗净并剔去多余成分的组织切成约1mm3大小的植块，用于植块培育。消化法：将获得洗净并剔去多余成分的组织剪碎蛋白酶溶液消化机械方吹打组织块对滤过液离心（<1000r/min, <10min）用培育液悬浮成细胞悬液计数并调整细胞密度用于分别细胞培育17何谓传代培育？简述贴壁细胞的传代操作步骤。传代培育是指细胞从一个培育瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培育瓶的培育。贴壁细胞传代培育： 选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培育液，参加23ml的D- Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞外表的碎片。参加适量0. 0.25胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下视察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。用Hanks液洗涤1次，参加适量培育液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。以1：2或1：3进展分装，并在培育瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀， 37 CO2培育箱培育。视察：细胞培育24h后，即可视察培育液的颜色及细胞的生长状况。18搜集细胞时一般常用的转速和时间是多少？转速：1000r/min；时间：5min19. 什么是冷冻保存？影响细胞冷冻保存效果的因素有哪些？冷冻保存(cryopreservation)：将体外培育物悬浮在加有冷冻爱护剂的溶液中，以肯定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70的超低温条件)，并在此温度下对其长期保存的过程。冷冻速率当冷冻速度过慢时，细胞脱水严峻，细胞体积严峻收缩，超过肯定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液局部结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。 冷冻保存温度：液氮温度(-196)是目前最佳冷冻保存温度。应用-70-80条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。复温速率 指在细胞复苏时温度上升的速度。一般来说复温速度越快越好。常规的做法是，在37水浴中，于12min内完成复温。 在冷冻复苏中遵循：慢冻速溶原则。冷冻爱护剂：是指可以爱护细胞免受冷冻损伤的物质。分为：浸透性： 常用甘油、DMSO 非浸透性甘油或二甲基亚砜这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，进步细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。 爱护机制：是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，浸透到细胞内，在细胞内外产生肯定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而爱护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过格外渗，避开了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在运用该类冷冻爱护剂时，须要肯定的时间进展预冷，让甘油或DMSO等充分渗到细胞内，在细胞内外到达平衡以起到充分的爱护作用。目前，DMSO的应用比甘油更为广泛。非浸透性冷冻爱护剂不能浸透到细胞内，一般是些大分子物质。20冻存的细胞一般如何复苏？1)将恒温水浴箱的温度调至3740。2)从液氮中取出冻存小管，马上投入3740温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在12min内完成复温。3)将细胞冻存悬液移入离心管，参加约5m1培育液，轻轻吹匀。 4)将细胞悬液经8001000 r/min离心5min。弃上清液。5)给细胞沉淀物参加完全培育液，轻轻吹吸匀称。将细胞悬液移入培育瓶内，加足培育液进展培育。21简述培育细胞的非玻璃化冻存过程。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70-80，然后投入液氮进展保存；该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。 冻存过程：(1)待冻存细胞悬液的打算 ：按常规方法消化处于对数生长期的细胞培育物,制备成单细胞悬液,计算细胞总数。将细胞悬液以8001000rmin离心5min，弃上清液。向沉淀物中参加冷冻液。轻轻吹吸匀称，使细胞密度达1×1061×107个/ml。按每管11.5ml的量，分装于冻存小管内。拧紧管盖。在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。(2)分级冷冻：先将冻存小管放人一般冰箱冷藏层(48)，约40min。接着置于一般冰箱冷冻层(-10-20)，3060min。再于-30放置30min左右（可省略）。然后在-70-80下过夜。最终将冻存小管投入液氮保存。还有一种简洁的方法，就是将冻存小管先悬挂在液氮罐口20 min，再干脆投入液氮中保存。第三种方法是，用4预冷的冷冻爱护液悬浮细胞，分装冻存小管后，将冻存小管放在4下30min；然后置于壁厚1 cm以上的泡沫塑料小盒内封好，马上将小盒放置在-70-80冰箱中24h以上至1周；再将冻存小管投入液氮中保存。 (3)记录：做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的状况、冻存位置以及冻存经手人。22DMSO运用时应留意哪些事项？在运用DMSO前，不须要对其进展高压灭菌，因其本身有灭菌作用。 在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制冷冻爱护剂时最好带手套。由于很多冷冻爱护剂(如DMSO)在低温条件下能爱护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温融解后要刚好洗除冷冻爱护剂。23. 细胞培育中常见有哪些微生物污染，有何主要特征？真菌污染：真菌种类多，形态各异，但污染后均不难发觉，大多呈白色或浅黄色小点漂移于培育液外表，肉眼可见；有的散在生长，镜下视察呈丝状、管状或树枝状菌丝，犬牙交织穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。细菌污染：污染后大多能变更培育液pH培育液变混浊，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。加用抗生素的培育用液一般可预防和解除个别少量细菌的污染。支原体污染：支原体是细胞培育中最常见、不易被发觉和干扰试验结果的一种污染。24运送细胞的比拟简便的方法是哪一种，简述其过程。一是用液氮或干冰保存运输，效果较好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，适于空运，比拟费事;二是充液法运输，比拟简便。充液法运输操作如下： 选生长状态良好的细胞，待达80%或90%集合时，去掉旧培育液换入新培育液，量要到达培育瓶的颈部(过满易污染)，保存少许空间，塞紧瓶塞，空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落; 妥当包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的状况下，对细胞活力无严峻影响; 到达后，倒出大局部培育液，保存正常量，置37培育，次日传代。25. 简述细胞污染的概念及种类.细胞污染: 凡混入培育环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，都视为污染。组织培育污染: 微生物：真菌、细菌、支原体和病毒；化学物质：影响细胞生存的非细胞所需的化学成分；细胞：不同细胞类型的穿插污染。26. 细胞培育中污染主要通过哪些途径，一般如何预防？空气: 培育设施不宜置于通风场所；定期清理净化工作台的过滤层，防止堵塞；操作中应削减空气流淌；带口罩；夏季潮湿季节空气中含菌数量多，每立方米内含菌数不应超过15个。清洗消毒：培育器皿和容器洗刷不净残留污物、培育用液灭菌不彻底等，都可引入有害物。操作：试验操作马虎、动作不精确、消毒观念不强，运用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口时不严，都可发生污染。同时培育两种以上细胞，操作不慎运用同一吸管或培育用液，可能导致细胞穿插污染。血清：血清也是污染细胞的来源，有的市售血清制备程度低、检测不严，常已被支原体和病毒污染。组织：初代培育组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本身可能是被污染的组织(如已发生溃烂的肿瘤组织)；手术用碘酒消毒后，擦拭不净可能混入碘污染 。27 细胞计数的操作要领及计算公式是什么？详细操作程序如下：取血细胞计数板和盖玻片，用75%酒精擦净。将盖玻片放于计数板上。用滴管取混合匀称的细胞悬液，滴入计数室内。要保证盖片下充溢悬液，留意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。滴加细胞悬液后约静置1分钟后则可以进展计数。统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下视察，并挪动计数板，分别数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数。对压边线细胞：计上不计下，计左不计右 计算：一般以每毫升含细胞数来表示，大方格的面积为1mm2，室深为0.1mm，则体积为0.1mm3。推算得0.1mm3×104，才为1ml体积。所以计算公式为：细胞悬液的细胞数）/ml （ 四个大格子细胞数/4) ×104 ×稀释倍数；计数中，假如细胞悬液的细胞浓度过高，必需稀释后再计；假如细胞数太少,可离心浓缩后再计。每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。 用细胞计数板计数时应留意的事项:不要漏计，不要重复细胞悬液应混合匀称浓度不行过高也不行过低。28. 简述细胞生长曲线绘制过程及其应用。细胞生长曲线(cell growth curve)是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，可依据细胞生长曲线分析细胞增殖速度，确定细胞传代、细胞冻存或详细试验的最佳时间。它以培育时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。 制作方法：培育细胞：首先在2孔培育板内分别接种一样数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。计数细胞密度：从接种时间算起，每隔24h计数孔内的细胞密度，算出平均值。为进步精确率，对每孔细胞可计数23次。如此操作至第七天完毕。绘制曲线：以培育时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培育细胞的生长曲线。29. 简述MTT比色法的原理及操作过程。原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将染料MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐)转变为不行溶性的紫色结晶，后者被DMSO（或酸性异丙醇）溶解后所呈现的色度(用OD值表示)反映出活细胞的代谢程度。死亡细胞则无此酶活性。1.MTT溶液的配制用PBS液(pH7.2)或者生理盐水将MTT配成5mgm1的溶液。（用0.2µm滤膜过滤）。保存：于4避光保存。可用2周。若暂不用，可冻存。 2.试验过程：（1）、将细胞培育于96孔培育板。（2）、按不同试验要求处理细胞。（3）、每孔参加15-20µlMTT液，接着培育34h。（4）吸去培育液，每孔参加200µlDMSO,在微型振荡器振荡5min,充分溶解混匀。（5）在酶标仪上测定光汲取。测定波长为490nm，以只加培育液的的培育皿为空白比照。3.结果分析 ：细胞存活率=试验组光汲取值/比照组光汲取值*1004.留意事项：(1)高浓度血清可影响光汲取值,常运用含10%血清的培育液,在参加异丙醇溶液或DMSO前尽量吸净培育液。(2)吸去培育液时动作要慢,以免吸去形成的结晶。30. 简述台盼蓝解除检测法原理原理：由于死细胞的细胞膜通透性发生变更，某些染料可大量进入却不被排出，因此细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因此不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反响而区分开两种细胞。最常用的为“台盼蓝解除检测法”(2)活体染色及细胞计数：将1滴细胞悬液(贴壁细胞可经0.25胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液)及2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。2min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。留意事项:台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，局部活细胞也会着色，会干扰试验结果。