壬基酚对赤子爱胜蚓的生态毒理学研究.docx

壬基酚对赤子爱胜蚓的生态毒理学研究赵晓祥，陈 琪，庄惠生*东华大学环境科学与工程学院，上海 摘要：环境激素对生态的影响越来越受到人们的重视。通过赤子爱胜蚓对壬基酚的滤纸接触法毒性试验，从分子水平揭示环境污染物对蚯蚓组织的毒性影响。在壬基酚对赤子爱胜蚓（ ） 的急性毒性试验中，测得 为 。在系列浓度的壬基酚暴露中，过氧化氢酶（，），超氧化物歧化酶（ ，）和谷胱甘肽硫转移酶（ ，）的敏感性依次为>>。实验结果表明，这三种酶均可作为早期污染预警指标。关键词：壬基酚；赤子爱胜蚓；过氧化氢酶；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽硫转移酶中图分类号： 文献标识码： 文章编号：（）壬基酚（, ）是一种非离子表面活性剂，广泛应用于造纸、纺织、橡胶塑料、洗衣粉和洗涤剂等中，与人们的日常生活关系十分密切。然而，研究表明，是一种环境内分泌干扰物，它具有与动物雌激素相似的结构，因而会对受污染生物的内分泌生理功能等产生负面作用。因此，正确了解壬基酚的负面生态效应对生态保护和维护人类自身的健康等均具有重要的现实意义。从研究报导来看，研究主要集中于污染物对蚯蚓的体重、生长和繁殖以与污染物在组织内的富集情况，缺少生化或细胞层次上的研究。该试验以为污染源，赤子爱胜蚓（ ）为材料，过氧化氢酶（，）、超氧化物歧化酶（ ，）、谷胱甘肽硫转移酶（ ，）为生物标志物进行毒理试验。 材料与方法 材料蚯蚓：赤子爱胜蚓，购于上海松江蚯蚓养殖场，体质量约 ，对污染物具有中等的敏感性。试验前在土壤中预培养一段时间后，选择大小差不多，体质量约 左右，环带明显的成蚓进行试验。试剂：壬基酚（, ）（公司），化学分子式为，化学结构式如下： 试验方法1.2.1 实验预处理将挑选的蚯蚓洗净表面泥土后放入 的已润湿的烧杯中，用塑料薄膜（已用尖嘴镊子在塑料薄膜上扎孔）封口，置于黑暗处清肠一昼夜（以除去肠道内的杂物等）。试验时，在直径为 的玻璃时间培养皿内垫入双层直径为 的滤纸。将用丙酮稀释成一定尝试梯度的试验液进行蚯蚓滤纸法的预试验，以确定对蚯蚓致死的剂量范围。1.2.2 高浓度急性毒性试验实验时将清肠后的蚯蚓表面冲洗干净后，用滤纸吸干蚯蚓表面的水分，每条蚯蚓放入一个培养皿中。在培养皿的盖子内侧垫上一层已用 水湿润的直径为 的滤纸，然后盖上培养皿盖以保证蚯蚓生活在温度相对稳定的环境中。将培养皿放在无光照的条件下培养 。1.2.3 低浓度慢性毒性试验在确定蚯蚓的 后，进行蚯蚓慢性毒性实验。设置空白对照组，空白对照组只添加溶剂丙酮；在蚯蚓的致死范围内设置个浓度梯度（ 、 、 ）进行蚯蚓慢性毒性试验。实验期间每天取各浓度蚯蚓条做平行试验，洗净剪取其环带前部分，用磷酸缓冲液洗掉表面血液，用滤纸吸干水分，放入研钵加 磷酸缓冲液进行研磨，再进行离心（ ·） ，上清液即为粗酶液。1.2.4 酶活力测定过氧化氢酶（）的测定方法：用贝尔斯西策尔斯（ ）法（改进型）测定过氧化氢酶，反应系统包括 底物溶液（磷酸盐缓冲液把 过氧化氢稀释至 ）、 蒸馏水和 粗酶溶液，调温至 。在 处以蒸馏水为参比在连续 内测定吸光度，每隔 读取次结果，直至每分钟吸光度的降低值达到稳定为止。按以下公式计算活性：式中： 处每分钟内吸光度的降低值每 所用酶液中含酶的质量（） 处 过氧化氢的吸光度反应混合液的总体积超氧化物歧化酶（）的测定方法：本实验选用改进邻苯三酚自氧化法测定活性，具体步骤如下：首先测定邻苯三酚自氧化速率：取 （ ）缓冲液， 蒸馏水，混匀后在水浴保温 ，取出后立即加入25 预热过的 ·邻苯三酚 （以 · 配制，空白管用 代替邻苯三酚的溶液），迅速摇匀倒入比色杯（光径 ），在25 恒温池中，每隔 测定吸光度值次。计算线性范围内每分钟的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速率。酶活力测定：加入邻苯三酚前，先加入一定体积的溶液，蒸馏水减少相应体积，其它均与上述中所述一致，计算加酶后邻苯三酚自氧化速率。每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达的酶量定义为一个酶单位。酶活性单位的计算公式如下：式中表示在 处的吸光度。本实验测得邻苯三酚的自氧化率为。图不同壬基酚暴露时间对蚯蚓酶活性的影响谷胱甘肽硫转移酶（）的测定方法： · （体积分数为的乙醇溶解）与 · （还原型谷胱甘肽）使用时现配。反应系统为缓冲液 ， ， ， ，制剂 ，对照用代替。在 处每隔 读数，连续读数 。反应产物 的 ··。酶活用 ·表示。 实验结果 高浓度急性毒性试验从实验可以观察到蚯蚓的中毒症状：蚯蚓放入浓度最高的培养皿中后立即表现中毒症状；身体呈极度蜷缩卷曲状态，身体红肿充血，不断地扭曲挣扎，丧失了爬行和逃避能力，有的蚯蚓体表出现黄色体液渗出于滤纸上，几小时后蚯蚓蜷缩卷曲状态较开始有些缓和，滤纸上出现血色脓状液体，在 内全部死亡。在浓度稍低一些的培养皿中蚯蚓在 内无明显中毒症状， 滤纸上出现血色脓状液体，身体变硬并呈现轻度卷曲状态，对刺激有较强的反应，开始出现环节肿大糜烂现象，有少数蚯蚓死亡。在浓度最低的培养皿中蚯蚓直至 无死亡。经次实验得出对蚯蚓 为 ·。 低浓度慢性毒性试验由 所得结果设置个慢性毒性试验浓度，分别为 ·、 ·、 ·。2.2.1 酶活性的变化由图可以看出，酶的活性随着暴露时间的延长有显著变化。空白对照组活性有所增加，可能是由于溶剂丙酮对机体也有影响，也会促使体内产生过量的活性氧，但活性增加比较平稳；从其他浓度不同的组可以看出，浓度高的组活性较先受到诱导，这可能是由于浓度越高使蚯蚓体内产生过量活性氧的速率增加，后受到抑制，这可能是由于底物过量，细胞受到损伤的原因。 组为浓度较低组，其受到诱导的最高峰出现在第天，比浓度较高的两组推迟了 。到第天时活性已经与 组的最高峰值相当，其原因可能是 的最高峰可能在第天和第天之间，由于取样时间的选择，错过其最高峰出现的时间。在染毒 内酶的活性变化明显，显示出酶对于早期污染具有指示作用。2.2.2 酶活性的变化由图可以看出，酶的活性同样随着暴露时间的延长有显著变化。酶活性先受到诱导后被抑制，在图中还可以看出，最大暴露浓度酶的诱导峰在第天最先出现。另外两组较低浓度组诱导峰出现在第天，可能是由于浓度越高使蚯蚓体内产生过量超氧阴离子自由基的速率增加，后受到抑制，这可能是由于底物过量，细胞受到损伤的原因。与酶相比，酶活性受到影响的时间略有延迟，这可能是由于最先引起蚯蚓组织内过量活性氧的产生，因此酶能够最早显示出对机体的影响。在染毒 内酶的活性有显著变化，显示出酶也对于早期污染具有指示作用。图 不同壬基酚暴露时间对蚯蚓酶活性的影响2.2.3 酶活性的变化由图可以看出，酶的活性同样随着暴露时间的延长有显著变化。酶活性先受到诱导后被抑制，在图中还可以看出，最大暴露浓度酶的诱导峰在第四天最先出现。浓度较低组组诱导峰出现在第天，而浓度最低组的诱导峰到第天似乎还没有出现，但从其趋势上可以看出酶的活性也是在受到诱导的，这可能是由于浓度越高使蚯蚓体内产生过量氧化型谷胱甘肽的速率增加，后受到抑制，这可能是由于底物过量，细胞受到损伤的原因。与酶和酶相比，酶活性的变化相对更加缓慢，但是在染毒 内酶的变化也比较明显，显示出酶也对于早期污染也具有指示作用。 讨论壬基酚对于水生生物的毒理学研究相关报道比较多，但是对于土壤生物的毒理学研究较少。本次实验的慢性毒性实验采用的是滤纸接触法染毒，与蚯蚓正常的生活环境不同，因此各种酶指标得出的结果势必受到影响，但是总体趋势不会受到很大改变。目前人们正在致力于研究能对污染物作出全面评价的指标，尤其是多指标联合评价环境污染物。由于酶指标是从生化水平上说明毒物对生物的影响，既能早期预警环境毒物的危害，又有助于阐明毒物的作用机制，将是今后研究的方向之一。参考文献： 张浩，曾祥贵，程薇波, 等. 壬基酚对成年雄鼠大鼠生殖功能的影响. 四川大学学报: 医学版，（）：. , , , . . Sichuan University , , (): .图不同壬基酚暴露时间对蚯蚓酶活性的影响 杨天鸣，邹国林. 超氧化物歧化酶化学研究进展.中南民族学院学报: 自然科学版，（）：. , . . South-Central University : , , (): . , Donghua University, Shanghai , China