凝胶色谱法.ppt
关于凝胶色谱法现在学习的是第1页，共16页现在学习的是第2页，共16页根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。用来分离不同种类的蛋白质。 一、基础知识一、基础知识现在学习的是第3页，共16页 大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖葡聚糖或或琼琼脂糖脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。 根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大小的大小，利用具有，利用具有网状结构网状结构的凝胶，来进行分离。的凝胶，来进行分离。现在学习的是第4页，共16页现在学习的是第5页，共16页现在学习的是第6页，共16页相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢; ;相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？生变性呢？现在学习的是第7页，共16页 能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。 通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PHPH范围范围内内使用的缓冲液。使用的缓冲液。磷酸缓冲液磷酸缓冲液, ,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠 如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？现在学习的是第8页，共16页带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些基下，这些基团会带上正电或负电。团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离分离。现在学习的是第9页，共16页琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。现在学习的是第10页，共16页 在测定蛋白质分子量时常用在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂烯酰胺和交联剂N,NN,N- -亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应现在学习的是第11页，共16页 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 。由几条肽链组成的蛋白。由几条肽链组成的蛋白质复合体在质复合体在SDSSDS的作用下会的作用下会，因此测定的，因此测定的结果只是结果只是。SDSSDS能与各种蛋白质形成能与各种蛋白质形成，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子质分子。因而掩盖了。因而掩盖了，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。现在学习的是第12页，共16页用用SDS SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法量的方法现在学习的是第13页，共16页现在学习的是第14页，共16页样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定蛋白质提取和分离步骤蛋白质提取和分离步骤（一）血红蛋白（一）血红蛋白现在学习的是第15页，共16页感谢大家观看8/21/2022现在学习的是第16页，共16页
