分子生物学实验.ppt

关于分子生物学实验现在学习的是第1页，共18页基因多态性多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型(genotype)或等位基因(allele)，亦称遗传多态性(genetic polymorphism)或基因多态性。DNA片段长度多态性基因多态性DNA重复序列多态性单核苷酸多态性 现在学习的是第2页，共18页DNA片段长度多态性(FLP)：即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA片段长度的变化，又称限制性片段长度多态性。DNA重复序列的多态性(RSP) ：主要表现于重复序列拷贝数的变异 ，如小卫星DNA和微卫星DNA。单核苷酸多态性(SNP) ：即散在的单个碱基的不同，基因组中单核苷酸的缺失,插入与重复序列不属於SNP，但更多的是单个碱基的置换。 现在学习的是第3页，共18页CLEC 是是C type lectin（C型凝集素）家族基因型凝集素）家族基因 CLEC4M基因是基因是19号染色体上号染色体上C型凝集素家族中的一员，它被型凝集素家族中的一员，它被证明是多种传染性疾病病毒的受体，如证明是多种传染性疾病病毒的受体，如HIV-1, SARS-Cov, HCV等。该等。该基因的第基因的第4外显子的外显子的VNTR (Variable Number of Tandem Repeats，VNTR )在全球人类群体中存在在全球人类群体中存在3-9次重复的多态现象，并被认为这种不次重复的多态现象，并被认为这种不同长度的多态可能和宿主对病毒的易感性有关。同长度的多态可能和宿主对病毒的易感性有关。 现在学习的是第4页，共18页现在学习的是第5页，共18页CLEC4M CLEC4M 与与SARSSARS体内存在一种SARS冠状病毒的受体L-SIGN，由CLEC4M基因所编码。该基因第4 4外显子存在3-93-9个6969bp的重复片段，人群中超过50%的人以7个重复为主，常见的基因型为7/77/7，5/55/5，7/5 7/5 等不同的纯合或杂合状态，这个重复区编码位于胞外受体的颈部。研究表明，纯合型如7/7或 5/5的个体较杂合型7/5的个体较少感染SARS病毒。现在学习的是第6页，共18页CLEC 4MCLEC 4M基因序列基因序列现在学习的是第7页，共18页实验原理原理：用裂解液和蛋白酶K裂解口腔黏膜细胞，释放DNA，用浓盐法沉淀蛋白质，离心去除蛋白质，再用异丙醇沉淀DNA。裂解液配方：10mM Tris-HCl，10mM KCl, 10mM MgCl2, 2mM EDTA, 0.4M NaCl, 1%SDS.现在学习的是第8页，共18页现在学习的是第9页，共18页2PCR mixddH2O引物1，引物22PCR mix 10l引物引物1，引物，引物2 各各0.4lddH2O 6.2l DNA样品样品 3l PCR反应体系，反应体系， 总共总共20 l现在学习的是第10页，共18页在在PCRPCR管盖上标记号码，便于辨认管盖上标记号码，便于辨认现在学习的是第11页，共18页放入放入PCRPCR仪，并设置程序仪，并设置程序变性变性 95 5min 5min 95 20s 20s30循环循环 59 30s 30s 72 45s 45s延伸延伸 72 5min 5min现在学习的是第12页，共18页PCR过程大概100分钟现在学习的是第13页，共18页PCR仪器界面和参数现在学习的是第14页，共18页紫外透射分析现在学习的是第15页，共18页点 样将PCR扩增产物加入琼脂糖凝胶孔内，点样量10l现在学习的是第16页，共18页100bp DNA marker，最亮的为500bp500bp杂合子，根据位置判断为589和727bp。杂带，分子量小，或是引物二聚体结果分析同学们，你们的基因是纯合还是杂合呢？现在学习的是第17页，共18页感谢大家观看2022-8-21现在学习的是第18页，共18页