体液蛋白质检验课件.ppt

关于体液蛋白质检验现在学习的是第1页，共82页一、血浆蛋白质的组成、功能及分类（一）血浆蛋白质的组成 血浆蛋白质是血浆固体成份中含量最多、组成复杂、功能广泛的一类化合物。占血浆固体成份90左右，目前已经研究的血浆蛋白质有500多种，分离出的纯品物200来种，除免疫球蛋白外，主要由肝细胞合成。蛋白质第一节第一节 概概 述述现在学习的是第2页，共82页 （二）血浆蛋白质的功能 1.营养作用 用于组织蛋白质的合成和氧化分解作用 2.维持血浆胶体渗透压 清蛋白（含量高、分子小） 3. 运输功能 如清蛋白能与多种物质结合（FA、胆红素） 而某些球蛋白具特异地运输某些物质的功 能，运铁蛋白、运皮质醇蛋白现在学习的是第3页，共82页 4. 维持血浆正常pH 血浆蛋白PI一般都小于7.4是弱酸，一部分的弱酸盐形式存在，构成缓冲对 5.免疫功能 血浆中具有免疫功能的蛋白质是补体和抗体，抗体又称免疫球蛋白（Ig）如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。具有免疫作用的非特异球蛋白补体。 6.凝血与纤溶作用 凝血与纤溶是一对矛盾的统一、凝血因子与纤溶因子绝大部分是血浆蛋白质，它们促进血液凝固，防止血液流失和溶解血栓，防止重要脏器的动脉栓塞。现在学习的是第4页，共82页 7.催化作用 血浆中有很多酶类，其中部分在血浆中发挥作用，称血浆功能性酶，参与血浆生理作用。如凝血酶原、纤溶酶原、铜蓝蛋白、LPL、LCAT、肾素等。8.其他生理功能 合成组织蛋白或氧化供能、抑制蛋白水解。现在学习的是第5页，共82页二、血浆蛋白质二、血浆蛋白质测定测定方法及评价方法及评价（1）总蛋白测定的常见方法物理法：凯氏定氮法（参考方法）双缩脲法（常规方法） 酚试剂法电泳法紫外分光光度法化学法：染料结合法比浊法免疫化学法现在学习的是第6页，共82页化学法凯氏定氮法（参考方法）是测定蛋白质的经典方法，1883年Kjeldahl首创，精密度准确度高，但操作复杂、费时、技术性强，不适合临床常规检测，一般用于标准血清的标定和校正。现在学习的是第7页，共82页双缩脲法n原理： 蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。 双缩脲生成双缩脲生成 加热NH322H180022222N 端C 端此方法简便、准确，但灵敏度较其它方法稍差，是目前临床上最常规的方法。现在学习的是第8页，共82页p参考范围：成人6080g/Lp临床意义：总蛋白升高：总蛋白降低：丢失过多 消耗增加 白蛋白合成减少 水肿真性升高：巨球蛋白血症、自身免疫性疾病等假性升高：机体明显失水，总蛋白含量相对升高 现在学习的是第9页，共82页酚试剂法n原理： 蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物 Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。现在学习的是第10页，共82页n评价及应用：优点：操作简单，改良法灵敏度高（10g-60g），适合测定蛋白含量少的标本。缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。 现在学习的是第11页，共82页比浊法n原理： n评价及应用：优点：简便不需特殊仪器。缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等） 某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。现在学习的是第12页，共82页物理法电泳法：n操作：醋酸纤维素薄膜电泳染色晾干透明光密度仪扫描洗脱比色染色分离测得蛋白组分百分比计算得出各种蛋白质含量半定量定量现在学习的是第13页，共82页n评价及应用：优点：电泳特异性好，可了解血清蛋白质全貌缺点：电泳技术繁琐，不易自动化；白蛋白与染料亲和力高会导致结果偏高现在学习的是第14页，共82页紫外分光光度法 蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。 （1）Lowry-Kalcker 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45 A 280 - 0.74 A 260 （2）Warburg-Christian 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55 A 280 - 0.76 A 260 n原理：现在学习的是第15页，共82页n评价及应用：优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性。缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm测定易受游离色aa和酪aa以及尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受影响。现在学习的是第16页，共82页染料结合法( 推荐)n原理: 血清ALB可通过离子键或疏水键与包括染料在内的各种有机离子结合,而GLB很少结合外源性染料,可在不分离ALB与GLB的情况下直接测定ALB。染料溴甲酚绿BCG溴甲酚紫BCP优点 缺点 易于和非人源性白蛋白结合 与白蛋白结合特异性较差 与白蛋白结合特异性好 与非人源性白蛋白结合力弱现在学习的是第17页，共82页4.免疫化学法n原理及特点:n应用：特异性高,但成本较高,费时,生化检验用的不多.现在学习的是第18页，共82页第二节第二节 血清总蛋白测定第二节血清总蛋白测定第二节 血清总蛋白测定血清总蛋白测定现在学习的是第19页，共82页生化检验中测定蛋白质的方法很多，主要利用蛋白质的分子组成，结构或性质进行。n方法：1.凯氏定氮法-参考方法 2.双缩脲法-推荐3.酚试剂法4.散射比浊法5.染料结合法6. UV 法.折光测定法现在学习的是第20页，共82页实验目的熟悉血清蛋白的测定方法（双缩脲法）掌握血清总蛋白测定的临床意义进一步巩固掌握721型分光光度计的使用现在学习的是第21页，共82页实验原理蛋白质中的肽键蛋白质中的肽键（-CONH-CONH-）在在碱性碱性溶液中能与溶液中能与CuCu2+2+作用而产生作用而产生紫红色络合物紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。白质的分子量及氨基酸成分无关。现在学习的是第22页，共82页 双缩脲反应并非是蛋白质特有的颜色反映！双缩脲反应并非是蛋白质特有的颜色反映！ 凡分子内含有凡分子内含有2 2个或个或2 2个以上甲酰基氨基（个以上甲酰基氨基（- - CONH2-CONH2-）均可呈双缩脲反映。）均可呈双缩脲反映。现在学习的是第23页，共82页【试剂】（1）6mol/L氢氧化钠：溶解240g优质纯氢氧化钠于新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，稀释至1L，置聚乙烯瓶内盖紧保存。（2）双缩脲试剂：称取未风化没有丢失结晶水的硫酸铜（CuSO45H2O）3g，溶于500ml新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，加酒石酸钾钠9g，碘化钾5g，待完全溶解后，加入6mol/L氢氧化钠100ml，并用蒸馏水稀释至1L。置聚乙烯瓶内盖紧保存。（3）双缩脲空白试剂：溶解酒石酸钾钠9g，碘化钾5g，于新鲜制备的蒸馏水中。加6mol/L氢氧化钠100ml，再加蒸馏水稀释至1L。（4）蛋白标准液：收集混合血清，用觊氏定氮法测定蛋白含量，亦可用定值参考血清或白蛋白标准血清。现在学习的是第24页，共82页实验操作取3支试管，按下表操作加入物（ml）测定管 标准管 空白管 待测血清0.1蛋白质标准液0.1蒸馏水0.40.40.5双缩脲试剂 3.0 3.0 3.0 现在学习的是第25页，共82页混匀，37水浴放置10分钟，以空白管调零点，在540nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。计算 测定管吸光度血清总蛋白（g/L）=-*蛋白质标准液浓度（g/L） 标准管吸光度标准曲线1.配制20g/L蛋白标准液2.取试管6支，标记后，按下表操作现在学习的是第26页，共82页血清蛋白质标准曲线绘制操作步骤加入物（ml）空白管1234520g/L蛋白质标准液-0.10.20.30.40.5蒸馏水0.50.40.30.20.1-双缩脲试剂3.03.03.03.03.03.0相当于血清蛋白质（g/L）020406080100现在学习的是第27页，共82页注意事项：注意事项：1.血清标本以新鲜为宜，含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现 混浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色2.蛋白标准液要澄清，如果浑浊应更换，否则需作标准空白管，以消除 浊度的影响。3.试管，刻度吸管应清洁，否则会有浑浊出现。4.高脂，黄疸及溶血标本应作清空白对照来校正误差。5.铵离子能与氢氧化铜反应，因此，实验所用器材不可含铵盐。现在学习的是第28页，共82页 【临床意义】（一）血清总蛋白增高 1. 血液浓缩 严重腹泻 、呕吐、高烧 2. 合成增加 主要见于球蛋白合成增加，多发性骨髓瘤。（二）血清总蛋白降低 1. 血液稀释 静脉滴注过多低渗溶液，各种原因所引起的水钠潴留。 2. 摄入不足和消耗增加 营养不良，慢性胃肠道疾病引起的 消化吸收不良，消耗性疾病，结核病、甲亢、恶性肿瘤。 3. 合成障碍 主要见于肝脏疾患。 4. 蛋白质丢失 严重烧伤，大量血浆渗出，肾病综合症。现在学习的是第29页，共82页第三节第三节 血清清蛋白测定第三节血清清蛋白测定第三节 血清清蛋白测定血清清蛋白测定现在学习的是第30页，共82页血清清蛋白测定（溴甲酚绿法）【原理】溴甲酚绿（BCG）在pH4.2的环境中，在有非离子去垢剂（Brij-35）存在时，可与清蛋白结合形成蓝绿色复合物，颜色的深浅在一定范围内与清蛋白含量成正比。 注意： BCG与清蛋白结合的特异性较低，它不仅与Alb结合呈色，还可与其他蛋白质呈色，其中1-球蛋白，TRF、Hp最明显，但反应速度不同，Alb可立即反应（快反应），其他蛋白质反应慢（慢反应）。现在学习的是第31页，共82页【试剂】1. 10mmol/L BCG贮存液 BCG1.75g，溶于5ml 1 mol/L NaoH溶液中，加蒸馏水至250ml。2. 0.5mol/L琥珀酸缓冲贮存液（pH 4.0）NaoH10g，琥珀酸56g，溶解于800ml蒸馏水中，用1mol/L NaoH溶液调pH至4.100.05加蒸馏水至1L。3. 叠氮钠贮存液 叠氮钠40g溶于1000ml蒸馏水中。4. 聚氧乙烯月桂醚Brij-35溶液 Brij-35 29g，加蒸馏水80ml，置80ml左右水溶使其溶解，然后加水至100ml。现在学习的是第32页，共82页 5. BCG试剂 于IL容量瓶内加蒸馏水400ml，琥珀酸缓冲贮存液100ml，BCG贮存液8ml，叠氮钠贮存液2.5ml，Brij-35溶液2.5ml，加蒸馏水至刻度，配好的BCG试剂的pH应为4.150.05。 Brij-35可提高蛋白质与染料的结合力及溶解度，提高呈色稳定性，如无Brij-35可用吐温-20代替，叠氮钠有防腐作用。 6. 清蛋白标准液现在学习的是第33页，共82页实验操作取3支试管，按下表操作加入物（ml）测定管 标准管 空白管 待测血清0.02清白质标准液0.02蒸馏水-0.02BCG试剂 4.04.0 4.0现在学习的是第34页，共82页混匀，放置10分钟，以空白管调零点，在630nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。计算 测定管吸光度血清清蛋白（g/L）=- *清蛋白标准液浓度（g/L） 标准管吸光度血清球蛋白血清球蛋白g/L=血清总蛋白血清总蛋白g/L- -血清清蛋白血清清蛋白g/L参考范围参考范围血清清蛋白血清清蛋白 35-55 35-55g/L血清球蛋白血清球蛋白 20-29g/L现在学习的是第35页，共82页2.临床意义血清清蛋白（1）清蛋白浓度增高： 除严重脱水，血浆浓缩而使清蛋白增高外，尚未发现单 纯清蛋白浓度增高的疾病。（2）清蛋白浓度降低：同总蛋白浓度降低。 1.1. 血液稀释血液稀释 静脉滴注过多低渗溶液，各种原因所引起的水钠潴。 2. 2. 摄入不足和消耗增加摄入不足和消耗增加 营养不良，慢性胃肠道疾病引起的消化吸收不良，消耗性疾病，结核 病、甲亢、恶性肿瘤。 3. 3. 合成障碍合成障碍 主要见于肝脏疾患。 4. 4. 蛋白质丢失蛋白质丢失 严重烧伤，大量血浆渗出，肾病综合症。现在学习的是第36页，共82页血清球蛋白 球蛋白的含量是通过血清总蛋白测定值减去血清清蛋白测值计算出的。 临床意义 球蛋白浓度增高：临床上球蛋白增高多见于炎症、免疫系统疾病和肿瘤1）细菌、病毒、寄生虫引起的急慢性感染：结核病、麻风病、疟疾、黑热病、血吸虫病、病毒性肝炎。 2）自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、硬皮病、风湿热、类风湿性关节炎等。 3）多发性骨髓瘤和淋巴瘤：多发性骨髓瘤是一种单克隆疾病，它是由浆细胞恶性增殖造成的异常高的单一Ig（多见于IgA或IgG）血症。淋巴瘤也属单克隆疾病。 球蛋白浓度降低：见于血液稀释、严重的营养不良、胃肠道疾病等。 现在学习的是第37页，共82页白蛋白与球蛋白的比例AG比值反映了清蛋白与球蛋白浓度变化的关系。正常AG比值为121.临床上常用AG比值来衡量肝脏疾病的严重程度，当AG比值小于1时，称比值倒置，为慢性肝炎或肝硬化的特征之一。 现在学习的是第38页，共82页第四节第四节 血浆纤维蛋白测定第四节血浆纤维蛋白测定第四节 血浆纤维蛋白测定血浆纤维蛋白测定现在学习的是第39页，共82页血浆纤维蛋白原测定 血浆纤维蛋白原（Fib）是一种参与血液凝固的糖蛋白，又称凝血因子，在肝脏合成，电泳时位于球蛋白区带。血浆纤维蛋白原测定对于出血性疾病和肝脏损伤的诊断有重要意义。现在学习的是第40页，共82页 复钙双缩脲法 原理在稀释血浆中加入钙离子使纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白凝块，将凝块分离后用双缩脲法测定纤维蛋白含量。 试剂1）225.2mmol/L氯化钙溶液： 2）154mmol/氯化钠溶液： 3）双缩脲空白试剂： 4）蛋白标准液： 现在学习的是第41页，共82页注意事项 1、标本要新鲜，放置过久会使结果偏低。 2、纤维蛋白凝块要完全卷起。 3、不能溶血，否则结果增高。 4、卷、挤、吸、洗、溶的过程要轻柔，避免纤维蛋白丢失。 测定管吸光度 0.01血清总蛋白（g/L）=-*标准蛋白质浓度（g/L）*- 标准管吸光度 0.5参考范围2-4g/L现在学习的是第42页，共82页二、热沉淀比浊法 原理 血浆经 pH6.3 KH2PO4-NaOH缓冲液稀释后，加热至56，使纤维蛋白原凝集而呈现浊度，而其它蛋白质仍处于溶解状态，用比浊法测定其含量。现在学习的是第43页，共82页热沉淀比浊法试剂 0.1mol/LKH2PO40.1mol/LNaOHKH2PO4-NaOH缓冲液现在学习的是第44页，共82页1.纤维蛋白原减少 1.原发性纤维蛋白原减少为罕见的遗传性疾病，通过常染色体隐性基因遗传，此患者肝脏不能合成纤维蛋白原。男、女两性均能发生，但以男婴为多见，患婴出生时，半数出现脐带出血。血液凝固缓慢. 2.继发性血浆纤维蛋白原减少由于纤维蛋白溶解酶溶解纤维蛋白所致。如胎盘早剥，分娩时羊水进入血管形成血栓，引起弥漫性血管内凝血，激活纤维蛋白溶酶原，使血中纤维蛋白溶酶活力增加，溶解纤维蛋白，消耗了体内原有的纤维蛋白原，使其含量减少。有时可降至0.5gL以下。 3.严重的肝实质损害如各种原因引起的肝坏死、慢性肝病晚期、肝硬化等都可出现纤维蛋白原的减少。此类疾病还常伴有凝血酶原及第七因子缺乏，往往是病情严重的先兆。 此外，严重的低纤维蛋白原血症也可见于肺及前列腺手术中。 现在学习的是第45页，共82页2.纤维蛋白原增加 纤维蛋白原是一种急性时相蛋白，其增加往往是机体的一种非特异反应，常见于下列疾病： （1）感染：如毒血症、肺炎、轻型肝炎、胆囊炎、肺结核及长期的局部 炎症等。 （2）无菌炎症：如肾病综合征、风湿热、恶性肿瘤、风湿性关节炎等。 （3）其他：如外科手术、放射治疗、月经期及妊娠也可轻度增高。 3.纤维蛋白原异常 纤维蛋白原异常是一种遗传性疾病，是常染色体显性遗传。患者纤维蛋白原含量可能在正常范围，但纤维蛋白原有质的异常。主要是纤维蛋白原分子的一个多肽上出现了一个异常的氨基酸，临床上可无症状或仅有轻度的出血倾向。现在学习的是第46页，共82页第五节第五节 血清黏蛋白白测定第五节血清黏蛋白白测定第五节 血清黏蛋白白测定血清黏蛋白白测定现在学习的是第47页，共82页血清粘蛋白血清粘蛋白占血清总蛋白量的1%2%，是体内一种粘多糖与蛋白质分子结合成的耐热复合蛋白质.属于体内糖蛋白的一种.其粘多糖往往是由氨基葡萄糖、氨基半乳糖、甘露糖、岩藻糖及唾液酸等组成。现在学习的是第48页，共82页酚试剂法酚试剂法酚试剂与粘蛋白分子中的酪氨酸残基作用,生成蓝色化合物.试剂试剂154mmol/L氯化钠溶液1.8mmol/L过氯酸溶液17.74mmol/L磷钨酸溶液酚试剂1.88mmol/L碳酸钠溶液酪氨酸标准溶液现在学习的是第49页，共82页实验操作取3支试管，按下表操作加入物（ml）测定管 标准管 空白管 蒸馏水1.751.51.75酪氨酸标准溶液0.25碳酸钠溶液0.500.500.50酚试剂 0.250.250.25现在学习的是第50页，共82页混匀，37水浴放置15分钟，以空白管调零点，在650nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。参考范围:0.710.87g/L现在学习的是第51页，共82页注意事项过氯酸为强氧化剂,按危险品保存,实验操作时多加小心.现在学习的是第52页，共82页临床意义 血清粘蛋白增高常见于各种急性或慢性炎症,病理性增生,组织破坏等如肿瘤（尤其是女性生殖器肿瘤）、结核、肺炎、系统性红斑狼疮、风湿热、风湿性关节炎等 血清粘蛋白减少常见于实质性肝病(如病毒性肝炎/中毒性肝炎/门静脉肝硬化等),甲状腺功能减退,肾病综合症.血清粘蛋白的连续测定对于同一病例病程的转归（病变的扩大或缩小、肿瘤有无转移、肿瘤手术切除或其他治疗效果）的判断有一定的参考价值。现在学习的是第53页，共82页第六节第六节 其他体液蛋白质测定第六节其他体液蛋白质测定第六节 其他体液蛋白质测定其他体液蛋白质测定现在学习的是第54页，共82页脑脊液蛋白质测定p脑脊液蛋白质来源:外源:经脉络膜的毛细血管壁超滤生成的内源:由中枢神经系统合成的脑脊液特有 蛋白质.现在学习的是第55页，共82页检测方法1.磺基水杨酸-硫酸钠比浊(SS-S)法2.邻苯三酚红钼络合显色法目的对改良的磺基水杨酸-硫酸钠比浊(SS-S)法测定脑脊液蛋白进行评价,选择一种快速、准确、低廉、适合临床常规检验的方法。现在学习的是第56页，共82页试剂磺基水杨酸-硫酸钠溶液叠氮钠生理盐水蛋白质标准液现在学习的是第57页，共82页实验操作取3支试管，按下表操作加入物（ml）测定管 标准管 空白管 脑脊液0.5-蛋白质标准溶液0.5生理盐水-0.5磺基水杨酸-硫酸钠溶液4.04.04.0现在学习的是第58页，共82页实验操作混匀，37水浴放置10分钟，以空白管调零点，在530nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。 测定管吸光度 脑脊液总蛋白质（g/L）=-*标准蛋白质浓度（g/L） 标准管吸光度参考范围新生儿 4001200mg/L儿童 200700mg/L成人 150400mg/L现在学习的是第59页，共82页临床意义临床情况 外观 总蛋白(mg-L) 健康成年人 无色、透明、澄清 150450 球菌性脑膜炎 脓性、混浊 100030000 结核性脑膜炎 无色、纤维薄膜 5003000，偶可达10000 病毒性脑膜炎 无色、清 5003000 癫痫 无色、清 5003000 脊髓肿瘤 无色、清 、黄变 100020000 脑瘤 无色、清 1502000 脑脓肿 清或微混 3003000 脑出血 无色、黄变或血性 3001500 多发性硬化症 无色、清 250800 现在学习的是第60页，共82页尿总蛋白测定p来源：来自血浆蛋白，主要是来自肾脏与尿路的组织蛋白。p临床应用：正常儿童40mg24h，成30mg130mg/24h ；异常：蛋白尿。p检测：用于泌尿系统疾病及一些全身性疾病的筛查、疗效观察，详见肾脏功能检验。现在学习的是第61页，共82页p检测方法:1、浊度法：蛋白质+磺基水杨酸-硫酸钠 沉淀 比浊（受温度等影响）H+2、邻苯三酚红钼络合显色法正电负电3、双缩脲比色法现在学习的是第62页，共82页试剂试剂1.显色试剂 邻苯三酚红 钼酸铵2.蛋白质标准液现在学习的是第63页，共82页实验操作取3支试管，按下表操作加入物（ml）测定管 标准管 空白管 生理盐水-0.1蛋白质标准溶液0.1标本0.1- 显色试剂5.05.05.0现在学习的是第64页，共82页实验操作混匀，37水浴放置10分钟，以空白管调零点，在600nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。 测定管吸光度 尿蛋白（g/L）=-*标准蛋白质浓度（g/L） 标准管吸光度参考范围随机蛋白质 10140mg/L24H尿蛋白 28141mg/24H现在学习的是第65页，共82页临床意义生理性蛋白尿高蛋白饮食、剧烈运动、发热、寒冷、精神过度紧张所导致的轻度、一过性蛋白尿。病理性蛋白尿肾小球、肾小管疾病所致的蛋白尿。1.肾小球性蛋白尿:急性肾小球性肾炎、急性肾功能衰竭、红斑狼疮性肾病等2.肾小管性蛋白尿:肾小管性酸中毒、肾盂肾炎、药物中毒等3.混合型蛋白尿：慢性肾炎、慢性肾盂肾炎以及糖尿病、系统性红包狼疮等全身性疾病等现在学习的是第66页，共82页第七节第七节 血清蛋白电泳分析第七节血清蛋白电泳分析第七节 血清蛋白电泳分析血清蛋白电泳分析现在学习的是第67页，共82页醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。现在学习的是第68页，共82页v带电粒子在电场作用下，向着与其所带电荷相反的方向泳动现象称为带电粒子在电场作用下，向着与其所带电荷相反的方向泳动现象称为电泳。电泳。v由于被分离物质各组分所带电荷的性质、数量和分子颗粒的大小、形状的不同由于被分离物质各组分所带电荷的性质、数量和分子颗粒的大小、形状的不同，在同一电场作用下其移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率（，在同一电场作用下其移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率（）不同，因此，经过一定时间电泳后即可被分离开来。）不同，因此，经过一定时间电泳后即可被分离开来。现在学习的是第69页，共82页v利用上述性质，将混合物中各组分进行分离分析的方法称为电泳法。电泳法应用十分广泛，是生物科学中非常重要的一门研究技术。v影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 v影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。现在学习的是第70页，共82页v采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。v醋酸纤维素薄膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小，该法具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。v本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。现在学习的是第71页，共82页清中各主要蛋白质的等电点均低于pH8.6，在该缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极移动。血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。现在学习的是第72页，共82页v醋酸纤维薄膜（醋酸纤维薄膜（28 cm）v常压电泳仪常压电泳仪v点样器（盖玻片）点样器（盖玻片）v培养皿培养皿v粗滤纸粗滤纸v载玻片载玻片v镊子镊子v人血清人血清v巴比妥缓冲液（巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度，离子强度0.07）v染色液（氨基黑染色液（氨基黑10B）v漂洗液漂洗液 现在学习的是第73页，共82页四、实验步骤 v 1. 浸泡：浸泡： 将将28 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光泽醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光泽面距短边一端面距短边一端1.5 cm处用铅笔轻轻画一条点样线，将之置于盛有处用铅笔轻轻画一条点样线，将之置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡缓冲液的平皿中，浸泡30 min以上后方可用于点样以上后方可用于点样 。（选择湿润。（选择湿润均匀、色泽深浅一致的薄膜进行电泳）均匀、色泽深浅一致的薄膜进行电泳）现在学习的是第74页，共82页v 2. 点样：点样： 用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板上冲液，然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝上无光泽面朝上)。在另一。在另一 载玻片载玻片上滴一滴血清，点样器上滴一滴血清，点样器(用盖玻片的一边用盖玻片的一边)在血清上蘸一下在血清上蘸一下(可来可来回移动一次回移动一次)，再将点样器轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，再将点样器轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线。，形成均匀的直线。现在学习的是第75页，共82页v 3. 电泳槽的准备：电泳槽的准备： 根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳缓冲液中。另一端浸入电泳缓冲液中。 当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥。现在学习的是第76页，共82页v 4. 电泳：电泳： 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下点样面朝下), 另一端另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10 min。通电，调节。通电，调节电压至电压至90110 V，电流强度为，电流强度为0.40.6 mA/cm膜宽度，电泳时间约膜宽度，电泳时间约5060 min 。v 5. 染色：染色： 电泳完毕后将薄膜取下电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡染色液的培养皿中浸泡5 min。现在学习的是第77页，共82页v 6. 漂洗：漂洗： 将薄膜从染色液中取出后先用自来水冲去多余染料将薄膜从染色液中取出后先用自来水冲去多余染料, 然后然后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱止，可得到色带清晰的电泳图谱 。现在学习的是第78页，共82页五、注意事项 v1. 市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在关键之一。若飘浮于液面的薄膜在1530 s内迅速润湿，整条薄膜内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳 。v2. 点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果。参差不起，影响分离效果。现在学习的是第79页，共82页五、注意事项 v3. 点样时，点样不要过多，恰到好处，动作要轻、稳，用力不能点样时，点样不要过多，恰到好处，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。v4. 醋酸纤维素薄膜电泳常选用醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥巴比妥钠缓冲液巴比妥巴比妥钠缓冲液,其浓度为其浓度为0.050.09 mol/L。(选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快区带扩散变宽；缓冲有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨现在学习的是第80页，共82页五、注意事项 v5. 放薄膜的时候毛面朝下，要注意放平，与滤网充分接触，但放薄膜的时候毛面朝下，要注意放平，与滤网充分接触，但不要接触点样端。不要接触点样端。v 6. 电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.40.6mA/cm膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。扩散。v 7. 操作过程为防止指纹污染，应戴手套。操作过程为防止指纹污染，应戴手套。现在学习的是第81页，共82页感谢大家观看现在学习的是第82页，共82页