人胚胎干细胞研究进展课件.ppt

现在学习的是第1页，共40页干细胞的基本概念干细胞的基本概念胚胎干细胞系的建立过程胚胎干细胞系的建立过程胚胎干细胞研究的进展情况胚胎干细胞研究的进展情况胚胎干细胞的研究意义胚胎干细胞的研究意义胚胎干细胞研究的困难及解决办法胚胎干细胞研究的困难及解决办法现在学习的是第2页，共40页 受精受精 卵裂卵裂 受精后受精后72h 受精后受精后5-7天天精子精子+卵子卵子 合子合子 卵裂球卵裂球 桑椹胚桑椹胚 囊胚囊胚 滋养层滋养层胎盘及胎儿附属结构胎盘及胎儿附属结构囊胚囊胚 内胚层内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。 内细胞群内细胞群 中胚层中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层外胚层体表结构；神经系统体表结构；神经系统现在学习的是第3页，共40页现在学习的是第4页，共40页现在学习的是第5页，共40页现在学习的是第6页，共40页1、定义定义：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。2、分类分类：（1）全能干细胞全能干细胞，包括：胚胎干细胞（，包括：胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞）细胞） 生殖干细胞（生殖干细胞（embryonic germ cells, EG细胞）细胞） 具有全能性，能够分化成全身具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，多种细胞类型， 进一步形成机体的任何组织和器官。进一步形成机体的任何组织和器官。（2）多能干细胞多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发 育成完整个体的能力。育成完整个体的能力。（3）专能干细胞专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。现在学习的是第7页，共40页现在学习的是第8页，共40页横向分化：横向分化：部分干细胞在特定条件下可以转化为其它细胞部分干细胞在特定条件下可以转化为其它细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞系。胞系。现在学习的是第9页，共40页l衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；l永生化永生化(immortal)；l能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；l有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；l能参与胎儿所有组织的发育过程；能参与胎儿所有组织的发育过程； 现在学习的是第10页，共40页分离囊胚的内细胞群 与成纤维细胞共培养，ES 细胞非分化增殖 分离胚胎生殖腺脊细胞 -胚胎干细胞的鉴定-定向诱导分化-成体干细胞-功能细胞 现在学习的是第11页，共40页现在学习的是第12页，共40页1、干细胞来源：、干细胞来源：(1) 发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞ES细胞细胞(2) 从从5-9周的胚胎生殖腺中分离出人的周的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞（细胞（embryonic germinate cells）(3)恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞 （embryonal carcinoma, EC)(4) 生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（SCNT）去核卵细胞去核卵细胞 + 体细胞核体细胞核 克隆克隆 囊胚囊胚 分离内细胞群分离内细胞群 ES细胞细胞现在学习的是第13页，共40页现在学习的是第14页，共40页现在学习的是第15页，共40页2、胚胎干细胞的分离、胚胎干细胞的分离酶消化后培养酶消化后培养免疫方法去处滋养层细胞免疫方法去处滋养层细胞流式细胞仪分离法流式细胞仪分离法现在学习的是第16页，共40页3、培养条件：、培养条件：(1) 特殊的培养液：用特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血清的培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；-巯基巯基乙醇。乙醇。(2) 以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。(3) 必须加入必须加入LIF，抑制细胞分化。，抑制细胞分化。现在学习的是第17页，共40页4、胚胎干细胞的鉴别、胚胎干细胞的鉴别胚胎干细胞具有以下特点：胚胎干细胞具有以下特点：(1) 细胞内碱性磷酸酶活性高细胞内碱性磷酸酶活性高(2)端粒酶活性高端粒酶活性高(3) 不被不被Hoechst33342 和和Rhodamine123染色染色(4) 细胞膜表面有特殊的标记：细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81(5) 能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植 入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤(6) 可诱导分化为各种成体干细胞可诱导分化为各种成体干细胞现在学习的是第18页，共40页现在学习的是第19页，共40页现在学习的是第20页，共40页现在学习的是第21页，共40页现在学习的是第22页，共40页 胚胎干细胞 生殖干细胞 SSEA-1 SSEA-3 SEA-4 TRA-1-60 TRA-1-81 AKP Oct-4 未知 端粒酶活性 滋养细胞 培养条件 滋养细胞 无血清培养 bFGF LIFbFGF Forskolin 现在学习的是第23页，共40页胚胎干细胞的诱导分化：胚胎干细胞的诱导分化： 胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胎牛血清，骨髓基质细胞共培养 胚胎干细胞胚胎干细胞-造血细胞造血细胞 RA 胚胎干细胞胚胎干细胞-神经细胞神经细胞 DMSO 胚胎干细胞胚胎干细胞-肌肉细胞肌肉细胞 TGF-B1, VEGF, bFGF 胚胎干细胞胚胎干细胞-血管和内皮细胞血管和内皮细胞 RA+胰岛素胰岛素+T3 胚胎干细胞胚胎干细胞-脂肪细胞脂肪细胞 BMP-2, BMP-4 胚胎干细胞胚胎干细胞-软骨细胞软骨细胞 地塞米松，磷酸甘油地塞米松，磷酸甘油 胚胎干细胞胚胎干细胞-骨细胞骨细胞 基因转染基因转染 胚胎干细胞胚胎干细胞-胰岛素分泌细胞胰岛素分泌细胞 现在学习的是第24页，共40页干细胞诱导分化的常用方法干细胞诱导分化的常用方法（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，）加入诱导细胞分化的因子或化学物质， 如如VGEF、bFGF 、DMSO和和RA等等（2）将）将ES细胞与特定的细胞共培养细胞与特定的细胞共培养 （3）将某种分化诱导因子的基因转入）将某种分化诱导因子的基因转入ES细细 胞内胞内 现在学习的是第25页，共40页鉴定干细胞的常用方法：鉴定干细胞的常用方法：（1） 细胞形态与结构细胞形态与结构（2）细胞功能）细胞功能（3）细胞表面的特殊标志）细胞表面的特殊标志 （4）细胞内特异基因的表达）细胞内特异基因的表达现在学习的是第26页，共40页造血干细胞的鉴定：造血干细胞的鉴定：（1） 细胞形态细胞形态 ：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小（2）细胞表面标志细胞表面标志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1); L/TAL-1； CD34；GATA-1；（3）基因表达基因表达：TAL-1；GATA-2 ；H1；主要珠蛋白主要珠蛋白 现在学习的是第27页，共40页 内皮细胞内皮细胞 :（1）细胞形态细胞形态：扁平贴壁状态：扁平贴壁状态 ；Weibel-Palade小体；广泛胞内连接；小体；广泛胞内连接；大量吞饮泡大量吞饮泡 （2）细胞标志：细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或或CD31；细胞粘；细胞粘附分子整合素附分子整合素v3 ；CD34 ；JAM(Junctional Adhesion Membrane) ；MECA-32以及以及MEC-14，7抗原抗原 （3）特异基因表达特异基因表达：flk-1；flt-1 ；tie-2 现在学习的是第28页，共40页心肌干细胞：心肌干细胞：（1）细胞结构细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛的未形成成熟：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛的未形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝肌原纤维的粗丝和细丝 （2）细胞功能细胞功能：节律性收缩：节律性收缩 ；心肌特异离子流。利用膜片钳技；心肌特异离子流。利用膜片钳技术可检测术可检测L型型Ica，Ina，Ito，Ik，Ik1，Ik，ACH和和If （3）基因表达基因表达：及及心肌球蛋白重链心肌球蛋白重链 现在学习的是第29页，共40页 神经干细胞神经干细胞 :（1）细胞形态细胞形态：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突 （2）细胞功能细胞功能：电压控制性：电压控制性Na+，K+，Ca2+通道；神经递质的受体通道；神经递质的受体 （3）细胞标志细胞标志：TH（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白tau，MAP2，微管蛋白微管蛋白3（TuJ-1），），GFAP（胶质原纤维酸性蛋白），巢蛋白（胶质原纤维酸性蛋白），巢蛋白，突触泡蛋白以及，突触泡蛋白以及NF-L（68KDa的神经丝蛋白），的神经丝蛋白），NF-H（200KDa的的神经丝蛋白），神经丝蛋白），NF-M（160KDa的神经丝蛋白）；的神经丝蛋白）；Nurr1和和Ptx3（中（中脑多巴胺能神经元的标志）脑多巴胺能神经元的标志） （4）特异基因表达特异基因表达：5天的天的EBs中有中有NF-L，NF-M和突触泡蛋白的和突触泡蛋白的表达，表达，2天后表达编码神经聚糖（脑特异蛋白多糖）的基因，天后表达编码神经聚糖（脑特异蛋白多糖）的基因，6天天后表达编码微管相关蛋白后表达编码微管相关蛋白tau的基因。也有检测发现分化细胞中有的基因。也有检测发现分化细胞中有Brain-3，谷氨酰胺受体亚单位，谷氨酰胺受体亚单位GluR-4和和GluR-6，递质合成酶，递质合成酶TH和和GAD67，GAD65，GFAP和和NF-L的表达的表达 现在学习的是第30页，共40页 胰岛细胞胰岛细胞 :细胞标志细胞标志：GATA-4（胚胎和胚外内胚层的标志），（胚胎和胚外内胚层的标志），HNF3（胚胎内（胚胎内胚层的标志）；胰岛素淀粉样多肽胚层的标志）；胰岛素淀粉样多肽IAPP；葡萄糖转运蛋白；葡萄糖转运蛋白-2（Glut-2） ；胰岛胰岛细胞的特征及特定标记物细胞的特征及特定标记物：胰岛：胰岛GK和和GLUT2（葡萄糖转运子）；（葡萄糖转运子）；转录因子转录因子IPF1/PDX1和和NgN3（Neurogenin3） 现在学习的是第31页，共40页胚胎干细胞研究的进展情况胚胎干细胞研究的进展情况 1981 年年， Evans 和和 Martin 分别成功的分离和体外培分别成功的分离和体外培养了小鼠的胚胎干细胞养了小鼠的胚胎干细胞 1995 年年，Thomson 等人分离建立了第一株灵长类动等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎干细胞。物的胚胎干细胞。 1998 年年，Thomson 等建立了第一株人类胚胎干细胞等建立了第一株人类胚胎干细胞 1998 年年，Shamblott 等建立了第一株人类生殖干细等建立了第一株人类生殖干细胞胞 2000 年，年，Reubinoff 等建立了两株人胚胎干细胞。等建立了两株人胚胎干细胞。 现在学习的是第32页，共40页 2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。 目前已有报导ES细胞能在适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。现在学习的是第33页，共40页 研究意义研究意义 人胚胎发育机制及影响因素的研究。人胚胎发育机制及影响因素的研究。 用于药物机理及毒性实验的研究，减少人体用于药物机理及毒性实验的研究，减少人体和动物的实验及临床研究。和动物的实验及临床研究。 将胚胎干细胞定向分化的细胞用于制造人体将胚胎干细胞定向分化的细胞用于制造人体细胞、组织和器官。细胞、组织和器官。 现在学习的是第34页，共40页 1999年年12月，美国月，美国科学科学杂志公布了当年世界科学进杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。 现在学习的是第35页，共40页现在学习的是第36页，共40页胚胚胎胎干干细细胞胞研研究究面面临临的的问问题题及及解解决决办办法法 用用于于干干细细胞胞研研究究的的胚胚胎胎来来源源困困难难 如如何何保保持持胚胚胎胎干干细细胞胞的的全全能能性性，并并控控制制向向特特别别类类型型细细胞胞转转化化？ 如如何何分分离离、纯纯化化干干细细胞胞？ 分分化化后后的的细细胞胞是是否否有有致致瘤瘤性性？ 干干细细胞胞在在体体外外发发育育成成完完整整的的器器官官尚尚难难以以做做到到。 分分化化细细胞胞移移植植仍仍有有可可能能发发生生免免疫疫排排斥斥 伦伦理理问问题题 现在学习的是第37页，共40页现在学习的是第38页，共40页避免免疫排斥的方法避免免疫排斥的方法（1）Knock-out 胚胎干细胞的组织相 容性抗原（2）Knock-in 受者的组织相容性抗原（3）与同一来源的造血干细胞一同移植（4）受者的体细胞核移植现在学习的是第39页，共40页感谢大家观看现在学习的是第40页，共40页