固定化酶催化反应过程.ppt

现在学习的是第1页，共119页1 1、水溶性酶应用过程中的一些不足、水溶性酶应用过程中的一些不足酶的稳定性较差酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶：除了某些耐高温的酶( (如如-淀粉酶、淀粉酶、TaqTaq酶等酶等) )及可以耐受较及可以耐受较低的低的pHpH条件条件( (胃蛋白酶等胃蛋白酶等)以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。因素影响下，都容易变性失活。 酶的一次性使用酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。的分离纯化带来一定的困难。 固定化酶固定化酶、概述、概述: :现在学习的是第2页，共119页通过物理或化学的方法使溶液酶转变为在一定的空通过物理或化学的方法使溶液酶转变为在一定的空间内其运动受到约束（完全或局部）的一种不溶于间内其运动受到约束（完全或局部）的一种不溶于水，但仍具活性的酶。它以固相状态作用于底物进水，但仍具活性的酶。它以固相状态作用于底物进行催化反应。行催化反应。水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术2 2、固定化酶固定化酶（固相酶或水不溶酶）：（固相酶或水不溶酶）：现在学习的是第3页，共119页3 3、固定化酶的研究历史、固定化酶的研究历史固定化酶的研究从固定化酶的研究从5050年代开始，年代开始，19531953年德国的年德国的 Grubhofer和和Schleith采用采用聚氨基苯乙烯树脂聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。6060年代后期，固定化技术迅速发展起来。年代后期，固定化技术迅速发展起来。19691969年，日本的千烟年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从固定化氨基酰化酶从DL-DL-氨基酸连续氨基酸连续生产生产L-L-氨基酸氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。，实现了酶应用史上的一大变革。在在19711971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。现在学习的是第4页，共119页优点优点: :(1)(1)在催化反应以后，固定化在催化反应以后，固定化酶容易酶容易从反应系统从反应系统中中分离分离出来，可以出来，可以反复使用反复使用，固定化后的酶，固定化后的酶大多数情大多数情况下其况下其稳定性增加稳定性增加. .(2)(2)产物不受污染产物不受污染, ,容易精制容易精制; ;(3)(3)固定化酶有一定的形状和机械强度，可以装固定化酶有一定的形状和机械强度，可以装 填在反应器中长期使用，便于实现生产连续填在反应器中长期使用，便于实现生产连续化和自动化。化和自动化。缺点：缺点： (1)(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。存在扩散限制。适于催化小分子物质。 (2)(2)酶活性下降。酶活性下降。4 4、固定化酶的优缺点、固定化酶的优缺点：现在学习的是第5页，共119页 固定化酶在工业生产中的应用固定化酶在工业生产中的应用: :5 5、固定化酶应用、固定化酶应用: :泵泵储罐反应产物离心离心机机消消旋旋反反应应器器固定固定化酶化酶柱子柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala固定化氨基酸酰化酶生产固定化氨基酸酰化酶生产L-L-氨基酸氨基酸; ;乙酰乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酸 乙酰乙酰 -D Ala现在学习的是第6页，共119页固定化葡萄糖异构酶生产高固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆果糖浆-世界上生产规模最大世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶，应用最为成功的一种固定化酶. .现在学习的是第7页，共119页固定化酶在生化制药中的应用固定化酶在生化制药中的应用: :固定化的青霉素酰化酶固定化的青霉素酰化酶生产制造各种半合成的青霉素和头孢霉素生产制造各种半合成的青霉素和头孢霉素 ; ;固定化固定化谷氨酸脱羧酶可以生产谷氨酸脱羧酶可以生产-氨基丁酸氨基丁酸, ,制成了制成了CO2CO2电极电极, ,可用于测定谷氨酸的含量。可用于测定谷氨酸的含量。固定化酶在医学上的应用固定化酶在医学上的应用: :固定化纤溶酶治疗血栓固定化纤溶酶治疗血栓, ,用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾等用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾等现在学习的是第8页，共119页 固定化酶在分析检测和环境保护中的应用固定化酶在分析检测和环境保护中的应用 ( (生物传感器是由生物活性物质与换能器组成的分析系统生物传感器是由生物活性物质与换能器组成的分析系统, ,可以简可以简便、快速地测定各种特异性很强的物质便、快速地测定各种特异性很强的物质 ) )现在学习的是第9页，共119页 固定化葡萄糖氧化酶传感器是其中应用最为广泛的一种固定化葡萄糖氧化酶传感器是其中应用最为广泛的一种, ,将葡将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和一种显色剂一起固定在试纸上萄糖氧化酶、过氧化氢酶和一种显色剂一起固定在试纸上, ,只要将只要将该试纸浸入被检尿样中几秒钟就可以马上检测出尿样的葡萄糖该试纸浸入被检尿样中几秒钟就可以马上检测出尿样的葡萄糖是否超标是否超标, ,从而断定该妇女是有血糖、尿糖还是妊娠。从而断定该妇女是有血糖、尿糖还是妊娠。 生化分析中最常用的生化分析中最常用的H H电极也绝大多数是固定化酶产品电极也绝大多数是固定化酶产品: :固定化固定化青霉素酶电极青霉素酶电极 重组海洛因酯酶传感器检测违禁药品重组海洛因酯酶传感器检测违禁药品 用聚丙烯酰胺凝胶包埋细菌电极可快速测定污水中的用聚丙烯酰胺凝胶包埋细菌电极可快速测定污水中的BODBOD。现在学习的是第10页，共119页载体结合法、交联法、包埋法载体结合法、交联法、包埋法. .1 1）载体结合法：）载体结合法：将酶结合于水不溶性载体的一种将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。固定化方法。物理吸附法物理吸附法离子结合法离子结合法共价结合法共价结合法结合的形式结合的形式6 6、固定化酶的制备方法、固定化酶的制备方法: :现在学习的是第11页，共119页离子结合法离子结合法：酶通过：酶通过离子键结合离子键结合于具有离子交换基的水不于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。溶性载体的固定化方法。载体载体: :多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂。多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂。DEAEDEAE纤维素、纤维素、GMGM纤维素等。纤维素等。特点特点: :操作简单，条件温和，酶活回收率较高操作简单，条件温和，酶活回收率较高, , 受缓冲液种类或受缓冲液种类或pHpH的影响，易从载体的影响，易从载体上脱落。上脱落。物理吸附法物理吸附法：酶被：酶被物理吸附物理吸附( (氢键氢键, ,疏水键疏水键) )于不溶性载体于不溶性载体的一种固定化方法。的一种固定化方法。载体载体: :活性炭、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、淀粉、合成树脂等。活性炭、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、淀粉、合成树脂等。特点特点: :酶活性中心不易被破坏，酶结构变化少，酶与载体相互作用力弱，酶易脱落。酶活性中心不易被破坏，酶结构变化少，酶与载体相互作用力弱，酶易脱落。现在学习的是第12页，共119页共价结合法共价结合法：酶以：酶以共价键结合共价键结合于载体的固定化方法，于载体的固定化方法，是载体结合法中应用最多的一种。是载体结合法中应用最多的一种。将载体有关基团活化，与酶有关基团发生偶联反应；或在载体上接一个双功将载体有关基团活化，与酶有关基团发生偶联反应；或在载体上接一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。可与载体结合的酶的功能团有氨基、羧基、羟基、能试剂，然后将酶偶联上去。可与载体结合的酶的功能团有氨基、羧基、羟基、酚基等。酚基等。代表性的方法有重氮法、溴化氰法等。代表性的方法有重氮法、溴化氰法等。特点特点: :反应条件比较苛刻，操作复杂，并引起酶高级结构产生变化，反应条件比较苛刻，操作复杂，并引起酶高级结构产生变化，破坏了部分活性中心，酶活回收率为破坏了部分活性中心，酶活回收率为3030左右。左右。现在学习的是第13页，共119页用双功能或用双功能或多功能试剂多功能试剂使酶与酶之间交联的固定化使酶与酶之间交联的固定化方法。它是利用共价键固定酶的，它方法。它是利用共价键固定酶的，它不使用载体。不使用载体。交联剂交联剂: :形成希夫碱的戊二醛、形成肽键的异氰酸酯、发生重氮偶形成希夫碱的戊二醛、形成肽键的异氰酸酯、发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺等。合反应的双重氮联苯胺等。特点特点: :结合牢固，可以长时间使用结合牢固，可以长时间使用, ,反应条件较激烈、酶活回收率低反应条件较激烈、酶活回收率低, ,颗颗粒较小粒较小, ,使用不便。使用不便。2 2）交联法）交联法：现在学习的是第14页，共119页可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。现在学习的是第15页，共119页网格型和微囊型两种。网格型和微囊型两种。将酶包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型；将酶包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型；将酶包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。将酶包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。特点特点: :酶的高级结构改变少，酶活回收率较高，包埋法只适合作酶的高级结构改变少，酶活回收率较高，包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶，因为只有小分子才可以通过高分子用于小分子底物和产物的酶，因为只有小分子才可以通过高分子凝胶的网格进行扩散。凝胶的网格进行扩散。适于网格型的高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯适于网格型的高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、明胶、海藻酸等。醇、淀粉、明胶、海藻酸等。 3 3）包埋法）包埋法现在学习的是第16页，共119页v微囊型微囊型特点特点: :固定化酶颗粒一般为直径是几微固定化酶颗粒一般为直径是几微米到几百微米的球状体，比网格型颗粒小米到几百微米的球状体，比网格型颗粒小得多得多, ,有利于底物和产物扩散有利于底物和产物扩散; ;半透膜能半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值大的医学价值.但反应条件要求高，制备但反应条件要求高，制备成本也高。成本也高。制备方法制备方法: :界面沉淀法界面沉淀法、界面聚合界面聚合法法、二级乳化法二级乳化法和和脂质体包埋法脂质体包埋法等等. .现在学习的是第17页，共119页这是一种采用表面活性剂和磷脂酰胆碱等物质，形成液膜来包埋酶的方法 。现在学习的是第18页，共119页现在学习的是第19页，共119页固定化方法固定化方法吸附法吸附法包埋包埋法法共价共价结合结合法法交联法交联法物理吸附法物理吸附法离子吸附法离子吸附法制备难易制备难易易易易易较难较难难难较难较难结合程度结合程度弱弱中等中等强强强强强强活力回收活力回收高，酶易流失高，酶易流失高高高高低低中等中等再生再生可能可能可能可能不能不能不能不能不能不能费用费用低低低低低低高高中等中等底物专一性底物专一性不变不变不变不变不变不变可变可变可变可变现在学习的是第20页，共119页v发展方向发展方向: :将酶固定在生物膜或超滤膜上将酶固定在生物膜或超滤膜上, ,制制造出来的生物膜反应器造出来的生物膜反应器; ;固定化细胞技术固定化细胞技术注注: :通过不同方法制得的固定化酶，必须制成不同型式的组件装通过不同方法制得的固定化酶，必须制成不同型式的组件装在反应器中进行酶催化反应，例如制成颗粒状、膜状、管状在反应器中进行酶催化反应，例如制成颗粒状、膜状、管状( (中空中空纤维纤维) )。现在学习的是第21页，共119页酶的固定化，不仅使酶的活性发生了变化，而且酶的固定化，不仅使酶的活性发生了变化，而且由于固定化酶使反应体系变为多相体系，例如液一由于固定化酶使反应体系变为多相体系，例如液一固体系固体系, ,气气- -液液- -固等，因此研究需结合以下两个方面固等，因此研究需结合以下两个方面: :考虑酶催化反应的本征动力学规律考虑酶催化反应的本征动力学规律; ;研究反应物的质量传递规律，及其对酶催化反应过程研究反应物的质量传递规律，及其对酶催化反应过程的影响。的影响。固定化酶催化反应动力学本质固定化酶催化反应动力学本质宏观动力学方程宏观动力学方程: :同时包括物质传质速率和催化反应速同时包括物质传质速率和催化反应速率的动力学方程。是设计固定化酶催化反应器和确定其率的动力学方程。是设计固定化酶催化反应器和确定其操作条件的理论基础。操作条件的理论基础。现在学习的是第22页，共119页溶液酶溶液酶固定化酶，其性质将会发生很大的变化。这种变固定化酶，其性质将会发生很大的变化。这种变化因酶的种类、所催化的反应、所用的载体和采用的固定化化因酶的种类、所催化的反应、所用的载体和采用的固定化方法的不同而不同。方法的不同而不同。3 31 1 固定化酶催化的动力学特征固定化酶催化的动力学特征 一、酶的固定化对其动力学特性的影响一、酶的固定化对其动力学特性的影响(1)(1)活性的变化。固定化时，部分酶未被固定而残活性的变化。固定化时，部分酶未被固定而残留在溶液中，造成了酶的部分损失；同时由于各种留在溶液中，造成了酶的部分损失；同时由于各种原因也会造成已被固定化的酶的活性有所下降。原因也会造成已被固定化的酶的活性有所下降。固定化酶的动力学仍服从固定化酶的动力学仍服从MMMM方程，可通过米氏常方程，可通过米氏常数数K K反映酶在固定化前后活性的变化。反映酶在固定化前后活性的变化。现在学习的是第23页，共119页某些游离酶和固定化酶的米氏常数某些游离酶和固定化酶的米氏常数酶酶固定化试剂固定化试剂底物底物Km/(mol/L)肌酸激酶无对氨苯基纤维素ATPATP6.510-48.010-4乳酸脱氢酶无丙酰-玻璃NADHNADH7.810-65.510-5-糜蛋白酶无可溶性醛葡聚糖ATEEATEE1.010-31.310-3无花果蛋白酶无CM-纤维-70BAEEBAEE210-2210-2胰蛋白酶无马来酸/1,2-亚乙基BAABAA6.810-3210-4ATP-三磷酸腺苷;NADH-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸;ATEE-N-乙酰-L-酪氨酸乙酯;BAEE-N-苯酰精氨酸乙酯;BAA-苯酰精氨酰胺大多数酶在固定化后，其大多数酶在固定化后，其KmKm值增加，表示催化反应活性将下降。也有少数酶固值增加，表示催化反应活性将下降。也有少数酶固定化后活性无变化，甚至有所增大。定化后活性无变化，甚至有所增大。现在学习的是第24页，共119页评价活性变化的两种指标：酶活力表现率和评价活性变化的两种指标：酶活力表现率和酶活力收率。酶活力收率。酶活力表现率酶活力表现率：实际测定的固定化酶的总活实际测定的固定化酶的总活力与被固定化了的酶在溶液状态时的总活力之力与被固定化了的酶在溶液状态时的总活力之比。比。酶活力收率酶活力收率：实际的固定化酶的总活力与固实际的固定化酶的总活力与固定化时所用的全部游离酶的活力之比定化时所用的全部游离酶的活力之比。活力表现率活力表现率= =固定化酶总活力固定化酶总活力/ (/ (加入酶的总活力加入酶的总活力- -上清液中未偶联酶活力上清液中未偶联酶活力) )100%100%活力收率活力收率=固定化酶总活力固定化酶总活力/加入酶的总活力加入酶的总活力100%现在学习的是第25页，共119页半衰期半衰期: :在连续测定条件下，固定化酶在连续测定条件下，固定化酶( (细胞细胞) )的活力下降为最的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以初活力一半所经历的连续工作时间，以t t1/21/2表示。表示。理论推测酶固定理论推测酶固定化后，其半衰期将增加一倍。化后，其半衰期将增加一倍。热稳定性热稳定性: :也有所提高，要比溶液酶提高也有所提高，要比溶液酶提高1010多倍。这是因为酶多倍。这是因为酶固定化后，酶的空间结构变得更为坚固，加热时不易变形，增固定化后，酶的空间结构变得更为坚固，加热时不易变形，增加了酶的热稳定性。加了酶的热稳定性。酶被固定化后，其稳定性有所增加，酶被固定化后，其稳定性有所增加，保存和使用时保存和使用时的的稳定性均有提高。稳定性均有提高。(2)(2)稳定性的变化稳定性的变化: :现在学习的是第26页，共119页构象效应：构象效应：酶在固定化过程中，由于酶和载体的相互作用，酶在固定化过程中，由于酶和载体的相互作用，引起了酶的活性部位发生某种扭曲变形，改变了酶活性部位的引起了酶的活性部位发生某种扭曲变形，改变了酶活性部位的三维结构，减弱了酶与底物的结合能力的现象。三维结构，减弱了酶与底物的结合能力的现象。屏蔽效应（位阻效应）屏蔽效应（位阻效应）：载体的存在使酶分子的活性基团不易载体的存在使酶分子的活性基团不易与底物相接触，从而对酶的活性部位造成了空间障碍，使酶的活性下降。与底物相接触，从而对酶的活性部位造成了空间障碍，使酶的活性下降。如在葡聚糖凝胶上共价交联胰蛋白酶的活性低于结合在琼脂糖的活性，如在葡聚糖凝胶上共价交联胰蛋白酶的活性低于结合在琼脂糖的活性，原因是葡聚糖凝胶的空间屏障大于琼脂糖。原因是葡聚糖凝胶的空间屏障大于琼脂糖。 二、二、固定化酶动力学的影响因素固定化酶动力学的影响因素 (1)(1)空间效应空间效应: :酶的活性部位和变构部位的性质取决于酶分子酶的活性部位和变构部位的性质取决于酶分子的三维空间结构的三维空间结构。 现在学习的是第27页，共119页当固定化酶处在反应体系的主体溶液中时，反应体系成为固液非当固定化酶处在反应体系的主体溶液中时，反应体系成为固液非均相体系。由于固定化酶的亲水性、疏水性及静电作用等引起固定酶均相体系。由于固定化酶的亲水性、疏水性及静电作用等引起固定酶载体内部底物或产物浓度与溶液主体浓度不同的现象载体内部底物或产物浓度与溶液主体浓度不同的现象分配效应。造分配效应。造成了底物浓度在两个环境中的不同，必然使酶的催化反应速率有所不成了底物浓度在两个环境中的不同，必然使酶的催化反应速率有所不同。同。 分配效应一般采用液固界面内外侧的底物浓度之比（分配系分配效应一般采用液固界面内外侧的底物浓度之比（分配系数）来定量表示。数）来定量表示。(2)(2)分配效应分配效应现在学习的是第28页，共119页界面内侧的底物浓度界面内侧的底物浓度为为Csg，界面外侧的底物，界面外侧的底物浓度为浓度为Csi,则分配系数则分配系数K为：为：K=CsgCsiCso液相主体的浓度，液相主体的浓度，Csi外扩散造成的界面外扩散造成的界面外侧浓度。外侧浓度。Csg由分配效应造成的微由分配效应造成的微环境的底物浓度。环境的底物浓度。现在学习的是第29页，共119页静电效应的影响表现在对静电效应的影响表现在对Km值的影响。值的影响。通常酶可能被固定在带电荷的酶膜上或载体上。底物在溶液中也通常酶可能被固定在带电荷的酶膜上或载体上。底物在溶液中也会离子化，这样在固定载体上的电荷和移动的离子之间，常会发生静会离子化，这样在固定载体上的电荷和移动的离子之间，常会发生静电交互作用，产生分配效应。使底物或产物浓度之间出现不均匀分布。电交互作用，产生分配效应。使底物或产物浓度之间出现不均匀分布。根据根据Boltzman分配定律，分配系数分配定律，分配系数K为为)exp(RTZFUKZ-底物分子所带电荷；底物分子所带电荷；F-法拉第常数；法拉第常数；U-静电电势。静电电势。 当载体与底物所带电荷相反时，即当载体与底物所带电荷相反时，即Z为正、为正、 U为负时，为负时，K大于大于1; 当两者带有相同电荷时，则当两者带有相同电荷时，则K小于小于1。现在学习的是第30页，共119页对固定化酶催化反应，其底物浓度应取在固定化酶内外表面附近的微对固定化酶催化反应，其底物浓度应取在固定化酶内外表面附近的微环境的数值，根据米氏方程，环境的数值，根据米氏方程，当当Z及及U 为异号，为异号，Km小于小于Km；反之，则；反之，则Km大于大于Km ；当任何一；当任何一方电荷为零时，方电荷为零时， Km不变。不变。 iiiiggSmSSmSSmSsCKCrRTZFUCKRTZFUCrCKCrrmaxmaxmax)exp()exp()exp(/RTZFUKKmm当载体与底物带不同电荷时，当载体与底物带不同电荷时，Km值减小，反应速率增大；带有相同值减小，反应速率增大；带有相同电荷时电荷时Km值增大，反应速率减小。其根源在于使微环境与主值增大，反应速率减小。其根源在于使微环境与主体溶液之间的浓度出现了差异。体溶液之间的浓度出现了差异。现在学习的是第31页，共119页(3)扩散效应：扩散效应：固定化酶对底物进行催化反应时，固定化酶对底物进行催化反应时，底物必须从主体溶液传递到固定化酶内部的催化活底物必须从主体溶液传递到固定化酶内部的催化活性中心处，反应得到的产物必须从酶的催化活性中性中心处，反应得到的产物必须从酶的催化活性中心传递到主体溶液中。心传递到主体溶液中。物质的传递过程有分子扩散和对流扩散。扩散过物质的传递过程有分子扩散和对流扩散。扩散过程的速率在某些情况下可能会对反应速率产生限制程的速率在某些情况下可能会对反应速率产生限制作用，由于生物物质在液体中的扩散速率相当缓慢，作用，由于生物物质在液体中的扩散速率相当缓慢，而酶的催化活性又很高时，这种扩散限制效应会相而酶的催化活性又很高时，这种扩散限制效应会相当明显。当明显。 现在学习的是第32页，共119页扩散限制效应有外扩散和内扩散限制效应。扩散限制效应有外扩散和内扩散限制效应。外扩散外扩散：底物从液相主体向固定化酶的外表面的一种扩散底物从液相主体向固定化酶的外表面的一种扩散, ,或是产物从固定化酶的外表面向液相主体中的扩散。外扩散是发生在或是产物从固定化酶的外表面向液相主体中的扩散。外扩散是发生在催化反应之前或之后。由于外扩散阻力的存在，使底物或产物在液相催化反应之前或之后。由于外扩散阻力的存在，使底物或产物在液相主体和固定化酶外表面之间存在着浓度梯度。主体和固定化酶外表面之间存在着浓度梯度。内扩散内扩散：指对有微孔载体的固定化酶，底物从固定化酶外指对有微孔载体的固定化酶，底物从固定化酶外表面扩散到微孔内部的酶催化中心处，或是产物沿相反途径的表面扩散到微孔内部的酶催化中心处，或是产物沿相反途径的扩散。对底物来讲，内扩散限制与酶催化反应同时进行。扩散。对底物来讲，内扩散限制与酶催化反应同时进行。现在学习的是第33页，共119页由于扩散限制效应的存由于扩散限制效应的存在，底物浓度从液相主体在，底物浓度从液相主体到固定化酶外表面，再到到固定化酶外表面，再到内表面是依次降低，而产内表面是依次降低，而产物浓度分布则相反。物浓度分布则相反。现在学习的是第34页，共119页分配效应分配效应造成的结果是使微观环境与宏观环境之间的底物造成的结果是使微观环境与宏观环境之间的底物浓度出现了差别，因而影响了酶催化的反应速率。如果在上浓度出现了差别，因而影响了酶催化的反应速率。如果在上述本征动力学的基础上，仅考虑由于这种分配效应而造成的述本征动力学的基础上，仅考虑由于这种分配效应而造成的浓度差异对动力学产生的影响，所建立的动力学称为固有动浓度差异对动力学产生的影响，所建立的动力学称为固有动力学力学。动力学方程动力学方程仍然服从仍然服从MMMM方程方程形式，仅对动力学参数形式，仅对动力学参数予以修正予以修正。空间效应空间效应难以定量描述，它与固定化的方法、载体的结构难以定量描述，它与固定化的方法、载体的结构及性质、底物分子大小和形状等因素有关。这属于酶工程及性质、底物分子大小和形状等因素有关。这属于酶工程的范围的范围。空间效应的影响可通过校正空间效应的影响可通过校正动力学参数动力学参数r rmaxmax和和KmKm来体现的来体现的。在此基础上建立起的动力学方程在此基础上建立起的动力学方程本征动力本征动力学。本征动力学是指酶的真实动力学行为，包括溶液酶学。本征动力学是指酶的真实动力学行为，包括溶液酶和固定化酶在内。固定化酶的本征动力学与溶液酶的本和固定化酶在内。固定化酶的本征动力学与溶液酶的本征动力学是有差别的。征动力学是有差别的。现在学习的是第35页，共119页扩散效应扩散效应: :固定化酶受到扩散限制时所观察到的速率统称为固定化酶受到扩散限制时所观察到的速率统称为有效反应速率（宏观反应速率）有效反应速率（宏观反应速率）。由于生化物质在溶液内和固由于生化物质在溶液内和固定化酶微孔内的扩散速率是比较慢的，因而定化酶微孔内的扩散速率是比较慢的，因而扩散阻力是影响固定扩散阻力是影响固定化酶催化活力的主要因素化酶催化活力的主要因素。并且所建立的宏观动力学方程也不并且所建立的宏观动力学方程也不完全服从完全服从MMMM方程形式方程形式。 现在学习的是第36页，共119页因此对一个非均相因此对一个非均相( (液一固液一固) )体系所建立的宏观动体系所建立的宏观动力学方程不仅包括酶的力学方程不仅包括酶的催化反应速率催化反应速率，而且还包括了，而且还包括了传质速率传质速率。这是固定化酶催化反应过程动力学的最。这是固定化酶催化反应过程动力学的最主要特征。主要特征。对固定化酶催化反应动力学，要考虑固定化酶本对固定化酶催化反应动力学，要考虑固定化酶本身的活性变化和底物等物质的传质速率的影响，身的活性变化和底物等物质的传质速率的影响，而传质速率又与底物等物质的性质和操作条件以而传质速率又与底物等物质的性质和操作条件以及载体的的性质等因素有关。及载体的的性质等因素有关。现在学习的是第37页，共119页32 外扩散限制效应外扩散限制效应固定化酶与液相反应物系相接触时，固定化酶与液相反应物系相接触时，反应过程反应过程包括三步包括三步：底物从液相主体扩散到固定化酶的外表面；底物从液相主体扩散到固定化酶的外表面；底物在固定化酶的底物在固定化酶的外表面上外表面上进行进行反应反应；产物从酶外表面扩散进入液相主体。产物从酶外表面扩散进入液相主体。三步是一串联过程。任意一步的速率发生三步是一串联过程。任意一步的速率发生变化，都影响到整个过程的速率。变化，都影响到整个过程的速率。现在学习的是第38页，共119页对非带电的固定化酶，其外表面上的反应速率符合对非带电的固定化酶，其外表面上的反应速率符合MM方程形式，即方程形式，即Rsi底物在固定化酶外表面上的消耗速率（宏观反应速底物在固定化酶外表面上的消耗速率（宏观反应速率），率），mol(LS)；Csi底物在固定化酶外表面上的浓度，底物在固定化酶外表面上的浓度，molL。simsisiCKCrRmax3.2.1 3.2.1 外扩散速率对酶催化反应速率的限制外扩散速率对酶催化反应速率的限制现在学习的是第39页，共119页底物由液相主体扩散到固定化酶外表面的速底物由液相主体扩散到固定化酶外表面的速率率R Rsdsd表示为表示为k kL L液膜传质系数，液膜传质系数，m ms s；aa单位体积的物系中所具有的传质表面积单位体积的物系中所具有的传质表面积; ;k kL Laa体积传质系数，体积传质系数，s s-1-1；C Csoso底物在液相主体中的浓度，底物在液相主体中的浓度，molmolL L。定态条件下，应存在定态条件下，应存在R Rsisi=R=Rsdsd，)(sisoLsdCCakR现在学习的是第40页，共119页simsiCKCrRmax)(sisoLCCak该式表示了在定态条件下，外扩散传质速率等于在固定化酶外表该式表示了在定态条件下，外扩散传质速率等于在固定化酶外表面上底物的反应速率。面上底物的反应速率。当当外扩散传质速率很快外扩散传质速率很快，而固定化酶外表面反应速率相对较慢，而固定化酶外表面反应速率相对较慢，并成为该反应过程速率的控制步骤时，并成为该反应过程速率的控制步骤时，则酶的外表面上底物浓，则酶的外表面上底物浓度应为液相主体溶液的浓度度应为液相主体溶液的浓度CsCs。此时的反应速率应为。此时的反应速率应为sosomsosirCKCrRmax现在学习的是第41页，共119页存在有存在有Cso=Csi。因此上式为没有外扩散传质速率影响的。因此上式为没有外扩散传质速率影响的本征反应速率，或称为在此条件下可能达到的最大反应速率本征反应速率，或称为在此条件下可能达到的最大反应速率rso。当外扩散传质速率很慢当外扩散传质速率很慢，而酶表面上的反应速率很快，此，而酶表面上的反应速率很快，此时外扩散速率成为反应的控制步骤时外扩散速率成为反应的控制步骤。固定化酶外表面上底物。固定化酶外表面上底物浓度趋于零。浓度趋于零。Rsi=kLaCso=rd现在学习的是第42页，共119页RsoCso-非线性非线性RdCso-线性线性当当Cso值较低时，值较低时，rsord，为外扩散控制，为外扩散控制，Rsi=rd当当Cso值较高时，值较高时，rso0a0，括号内取，括号内取“+号；当号；当a0a0，则应，则应取取“一一号。号。求出求出Csi值，再求出宏观反应速值，再求出宏观反应速率率Rsi值。值。 aD 14122KCs1KDa现在学习的是第45页，共119页Da是一个无因次数群。其物理意义为：是一个无因次数群。其物理意义为：当当Dal时，则底物最大扩散速率要低于酶催化底时，则底物最大扩散速率要低于酶催化底物的反应速率，此时该反应过程为传质扩散控制。物的反应速率，此时该反应过程为传质扩散控制。最大传质速率最大反应速率soLaaCkrDmax底物在固定化酶外表面处的浓度应同时满足传质速率方程底物在固定化酶外表面处的浓度应同时满足传质速率方程式和反应速率方程式，因此可通过作图法求出式和反应速率方程式，因此可通过作图法求出CsCsi i值和相值和相应的速率值应的速率值 。现在学习的是第46页，共119页图中曲线图中曲线1为底物为底物S的反的反应本征动力学曲线；直线应本征动力学曲线；直线2为传质速率方程；直线斜率为传质速率方程；直线斜率为为kLa；直线与曲线交点为；直线与曲线交点为方程的解，对应横坐标值为方程的解，对应横坐标值为其表面底物浓度其表面底物浓度Csi，交点，交点对应的纵坐标值为所求的对应的纵坐标值为所求的表面反应速率表面反应速率Rsi。simsiCKCrmax)(sisoLCCak现在学习的是第47页，共119页如果是如果是带电的固定化酶带电的固定化酶放在电离了的底物溶液中，放在电离了的底物溶液中，则表示外扩散速率影响的宏观速率应为则表示外扩散速率影响的宏观速率应为)(eCCaMkRsisoLsisimsiCKCrmaxaSsDCKeC)(1 (1eKDaDar422maxsiRsoLaaCMkrDmax-与静电分布有关的参数，与静电分布有关的参数，M-修正系数修正系数现在学习的是第48页，共119页（2）外扩散有效因子外扩散有效因子E E，求，求R RSiSi值。值。 E E的定义为：的定义为：用无因次形式得：用无因次形式得：有外扩散影响时的实际反应速率为：有外扩散影响时的实际反应速率为：sosiErR速率无外扩散影响时的反应反应速率有外扩散影响时的实际KCKCssE)1 (soEsirRsomsoECKCrmax现在学习的是第49页，共119页当当 时，时，Rsirso，表明固定化酶外表面处底，表明固定化酶外表面处底物浓度与液相主体浓度相同，反应没有受到外扩散传质速物浓度与液相主体浓度相同，反应没有受到外扩散传质速率的限制影响；率的限制影响；当当 时，则表明由于外扩散传质速率较慢，时，则表明由于外扩散传质速率较慢，已在某种程程度上限制了反应速率已在某种程程度上限制了反应速率；当当 时，则宏观反应速率实际上由外扩散传时，则宏观反应速率实际上由外扩散传质速率所控制。质速率所控制。当反应过程为外扩散控制时，当反应过程为外扩散控制时，Dal，有：，有： 1E1EaEDK11E现在学习的是第50页，共119页此时反应宏观速率可表示为：此时反应宏观速率可表示为：Rsi=kLaCs0 一级反应动力学一级反应动力学当反应过程为动力学控制时，当反应过程为动力学控制时，Da1，有：，有：Rsi=rso为了使为了使 尽可能增大到尽可能增大到1，应控制操作条件使，应控制操作条件使Da值值尽可能小，即提高尽可能小，即提高kLa值。一个有效的方法是提高值。一个有效的方法是提高液体流速。液体流速。在消除了外扩散的影响时所测得的宏观反应速率在消除了外扩散的影响时所测得的宏观反应速率实际上反映了本征反应速率。实际上反映了本征反应速率。 1EE现在学习的是第51页，共119页引入无因次底物液相引入无因次底物液相主体浓度为主体浓度为 不同不同值下，与值下，与Da的的关系表示如图关系表示如图 当当Da和和已知，可确已知，可确定定 但需要已知其本征动力但需要已知其本征动力学参数学参数r rmaxmax和和K Km m，而这些参数，而这些参数又是不受外扩散影响的反应又是不受外扩散影响的反应中求得的中求得的KKCms10E现在学习的是第52页，共119页引入可观察的丹克莱尔准数引入可观察的丹克莱尔准数 式中没有反应的本征动力学参数。用式中没有反应的本征动力学参数。用 来来求值要比用求值要比用DaDa更为方便。更为方便。aD0sLsiaCkRaD宏观反应速率的反应速率实测的有外扩散影响时siRaDsiRKrCKCrEsomsoE1maxmax11)1 (0maxDaKDaCkKraDEaEsLE知知故故现在学习的是第53页，共119页在不同在不同值下值下， 与与 作作图。用该图很图。用该图很容易由容易由 值确值确定定 值。值。aDEEaD现在学习的是第54页，共119页外扩散对反应过程外扩散对反应过程速率的影响还可从速率的影响还可从EHEH图看到图看到 maxmaxrKRrRsiEsi当当DaDa值较小时，为动力学控制，值较小时，为动力学控制，该关系表示为一直线；该关系表示为一直线；随着随着DaDa值的增大，外扩散影响程度值的增大，外扩散影响程度在增加，关系曲线明显偏离直线。在增加，关系曲线明显偏离直线。通过该图可检验外扩散对反应通过该图可检验外扩散对反应的限制程度。的限制程度。现在学习的是第55页，共119页对任意对任意n n级反应级反应ARAR，本征速率方程为，本征速率方程为 naraCkr akCkDaLnar1DaE11n=1 现在学习的是第56页，共119页33 内扩散限制效应内扩散限制效应对包埋或吸附于多孔性载体中的固定化酶，其催化对包埋或吸附于多孔性载体中的固定化酶，其催化反应发生的主要部位是在颗粒的内部。内扩散的阻力反应发生的主要部位是在颗粒的内部。内扩散的阻力主要是微孔内的阻力。阻力的大小与固定化酶颗粒内主要是微孔内的阻力。阻力的大小与固定化酶颗粒内部的物理结构参数、反应物系的性质等因素有关。部的物理结构参数、反应物系的性质等因素有关。3.3.1 3.3.1 载体的结构参数与微孔内的扩散载体的结构参数与微孔内的扩散研究内扩散对动力学的影响时，常将均匀分布着研究内扩散对动力学的影响时，常将均匀分布着酶的多孔球形颗粒为研究模型。先研究颗粒载体的酶的多孔球形颗粒为研究模型。先研究颗粒载体的结构参数和流体在载体微孔内的扩散。结构参数和流体在载体微孔内的扩散