基因工程与分子生物学常用技术.ppt

现在学习的是第1页，共34页 (Genetic Engineering and Genetic recombination) 一、基因工程的基本概念 不同来源的DNA分子可以通过磷酸二酯键连接形成重新组合的DNA分子，称为DNA重组。 将基因进行克隆，并表达制备特定的产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工程。现在学习的是第2页，共34页Hin d 属 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶5GAATTC33CTTAAG5现在学习的是第3页，共34页 不同的限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有3种不同的情况：现在学习的是第4页，共34页现在学习的是第5页，共34页现在学习的是第6页，共34页1. 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，称为载体。2. 载体的选择标准质粒噬菌体病毒3.常用载体现在学习的是第7页，共34页可赋予宿主细胞某些遗传性状。现在学习的是第8页，共34页现在学习的是第9页，共34页现在学习的是第10页，共34页二、重组DNA技术的基本原理和过程现在学习的是第11页，共34页现在学习的是第12页，共34页现在学习的是第13页，共34页 现在学习的是第14页，共34页现在学习的是第15页，共34页现在学习的是第16页，共34页 分切接转筛分离目的基因 限制酶切目的基因与载体拼接重组体 转入受体菌 筛选重组体 现在学习的是第17页，共34页2. 特点 针对性强、特异性强、灵敏度高、适应性强。三、基因诊断和基因治疗1.基因诊断是指利用分子生物学技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。(一)基因诊断(gene diagnosis) 现在学习的是第18页，共34页1. 基因治疗是指以正常基因矫正、替代缺陷基因，或从基因水平调控细胞中缺陷基因表达的一种治疗疾病的方法。2. 狭义的基因治疗是指将目的基因导入靶细胞，与宿主细胞的基因整合后表达以达到治疗疾病的方法。 3. 广义的基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用以达到治疗疾病的方法。 (二)基因治疗(gene therapy)现在学习的是第19页，共34页5.基因治疗的基本程序(1)选择和制备目的基因：治疗性基因。(2)选择基因转运载体：通常选择病毒载体。(3)选择靶细胞：体细胞、生殖细胞。(4)转移基因：将治疗基因导入并表达。4.基因治疗的基本策略基因增补基因置换基因矫正基因失活基因疫苗现在学习的是第20页，共34页 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 是指利用DNA复性原理，把不同来源的DNA单链或DNA与RNA混合，如单链分子间有碱基配对关系，则可形成杂化双链的过程。一、核酸分子杂交技术现在学习的是第21页，共34页现在学习的是第22页，共34页。现在学习的是第23页，共34页现在学习的是第24页，共34页现在学习的是第25页，共34页 1. PCR有三个反应步骤DNA的变性 DNA与引物的退火(复性)引物的延伸。现在学习的是第26页，共34页n个循环加热变性模板DNA退火DNA延伸P25 35 35 3 3P15 2.变性复性延伸这三个步骤为一个循环，每次循环的产物作为下个循环的模板，如此循环多次， 则DNA成指数扩增。现在学习的是第27页，共34页PCR反应体系： 1. 引物 是PCR特异性反应的关键，取决于引物与模板DNA互补的程度。 2. 酶浓度酶催化的PCR反应的Taq DNA聚合酶量约需2.5U。 3. dNTP的质量dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当，易变性失去生物学活性。 4. 模板核酸模板核酸的量与纯化程度是PCR成败与否的关键环节之一。现在学习的是第28页，共34页1可分析基因转录产物；构建cDNA文库；克隆特异cDNA；合成cDNA探针。2可判断突变的基因片段，如癌基因和抑癌基因中点突变的检测和鉴定。3用于病原微生物的微量检测及鉴别菌株；突变基因的筛选；法医学鉴定；DNA序列分析；器官移植配型等。4应用于遗传性疾病的诊断如地中海贫血、苯丙酮酸尿症等；感染性疾病如肝炎、结核等诊断。5根据已知致癌基因顺序设计特异的模板和引物，用于筛选特异的抗肿瘤化合物。现在学习的是第29页，共34页(一)DNA链末端合成终止法(Sanger法) 现在学习的是第30页，共34页采用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子发出不同波长荧光，采集荧光信号，确定DNA碱基的排列顺序。 DNA自动测序结果举例(二)DNA自动测序现在学习的是第31页，共34页是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。包括基因组DNA文库和cDNA文库。(一)基因芯片(gene chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。包括DNA芯片(DNA chip) 和cDNA芯片 (cDNA chip) 。现在学习的是第32页，共34页是将蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，可特异性与待测样品中的靶蛋白反应，再进行定性或定量分析的技术。(二)蛋白质芯片(protein chip)(三)生物芯片技术的应用主要应用于大量生物样品的快速、高效、灵敏的定量分析，如测序和突变检测。可应用于基因表达研究的分析，如基因功能分析、疾病发生机制探讨、药物筛选研究等。现在学习的是第33页，共34页感谢大家观看现在学习的是第34页，共34页