大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定(3页).doc

-大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定目的1掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。2了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。试剂大蒜， 磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l)(PH8.3)， 氯仿乙醇混合液冷丙酮， 邻苯三酚， 浓盐酸 方法1SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mlPH7.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2.除杂蛋白 ：提取液加入1/4体积的氯仿乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3.SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml混匀。6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。取1ml备用，其余量取体积。2. 大蒜SOD的提取液活性测定提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，1）溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 ×粗酶液稀释:20 ×酶液稀释:10 × 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 0.74A260) ×稀释倍数 计算酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量)总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力 试验结果记录：1）  试剂管  OD1OD2空白管对照管提取液粗酶液酶液光吸收值（A）00.0810.0410.0680.0132）蛋白质含量的测定： 提取液粗酶液酶液光吸收值(A)（260nm）0.4350.7600.185光吸收值(A)（280nm）0.3060.5100.144 3）提取液：酶活力单位U/ml = 4.0 总活力 U = 41.2 蛋白质浓度（mg/ml）= 6.09 比活力 U/mg = 0.6568粗酶液:  酶活力单位U/ml = 1.3 总活力 U = 12.78 蛋白质浓度（mg/ml）= 3.542 比活力 U/mg = 0.3670酶液: 酶活力单位U/ml = 6.8 总活力 U = 65.96 蛋白质浓度（mg/ml）= 0.719 比活力 U/mg = 9.4576 4）粗酶液: 纯化倍数 = 0.56  回收率 = 0.31 酶液: 纯化倍数 = 14.40 回收率 = 1.60 实验结果讨论：粗酶液的实验结果较为正确，操作较为得当，试剂添加较为合理。但是酶液的纯化倍数较大，而且，回收率好像不太正确，值偏大，可能是添加试剂时的量不太准确，或可能与添加了过多的石英砂有关。或者是离心时有部分液体渗出导致引入误差。下次实验应多加注意，小心用量与操作细节与步骤，争取桌做得更好！-第 3 页-