实验5金黄色葡萄球菌的检验(4页).doc

-实验5 金黄色葡萄球菌的检验1 目的和要求（1）掌握金黄色葡萄球菌的检验方法（2）了解金黄色葡萄球菌各检验步骤的依据及原理2 基本原理金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可以引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在是中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。因此，检验食品中金黄色葡萄球菌是实际意义。绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热的DNA酶。3 实验材料3.1 检样 乳与乳制品（如奶粉、消毒乳）、肉制品、饮料3.2 菌种 金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌斜面培养物。3.3 培养基 7.5%氯化钠肉汤、肉浸液肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker氏培养基3.4 试剂与染色剂 无菌生理盐水、兔血浆、革兰氏染色液等。3.5 仪器与其他用具 无菌吸管（1mL、5、10）、无菌试管、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、均质器、恒温箱等。4 检样程序5 操作步骤5.1 5.1.1样品的处理称取 25 g 样品至盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质 1 min2 min，或放入盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min2 min。若样品为液态，吸取 25 mL 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。5.1.2 增菌和分离培养5.1.2.1 将上述样品匀液于 36 ±1 培养 18 h24 h。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。5.1.2.2 将上述培养物，分别划线接种到 Baird-Parker 平板和血平板，血平板 36 ±1 培养 18 h24 h。Baird-Parker 平板 36 ±1 培养 18 h24 h 或 45 h48 h。5.1.2.3 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上，菌落直径为 2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。5.1.3 鉴定5.1.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5 m1 m。5.1.3.2 血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 ±1培养 18 h24 h。取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中，再加入 BHI 培养物 0.2 mL0.3 mL，振荡摇匀，置 36 ±1温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 ±1培养 18 h48 h，重复试验。病原性葡萄球菌多数产生血浆凝固酶，非病原性的一般不产生。因此，该法是判定葡萄球菌有无致病性的重要指标。5.2 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数5.2.1 样品的稀释5.2.1.1固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000 r/min均质1 min2 min，或置盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2 min，制成1:10的样品匀液。5.2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。5.2.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。5.2.1.4 按 5.2.1.3 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管或吸头。5.2.2 样品的接种根据对样品污染状况的估计，选择 2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行 10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液以 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别加25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质45 h48 h入三块Baird-Parker平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在 25 50 的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。5.2.3 培养5.2.3.1.在通常情况下，涂布后，将平板静置 10 min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱 36 ±1培养 1 h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36 ±1 培养，45 h48 h。5.2.4 典型菌落计数和确认5.2.4.1 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上，菌落直径为 2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。5.2.4.2 选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度 3 个平板所有菌落数合计在 20 CFU200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果：a）只有一个稀释度平板的菌落数在20 CFU200 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；b） 最低稀释度平板的菌落数小于 20 CFU 且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；c） 某一稀释度平板的菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d） 某一稀释度平板的菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落数不在 20 CFU200 CFU 之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；以上按公式（1）计算。e） 2 个连续稀释度的平板菌落数均在 20 CFU200 CFU 之间，按公式（2）计算。5.2.4.3 从典型菌落中任选 5 个菌落（小于 5 个全选），分别按 5.3.2 做血浆凝固酶试验。5.2.5 结果计算：公式（1）：式中：T样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A某一稀释度典型菌落的总数；B某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；C某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数；d稀释因子。公式（2）：式中：T 样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A1第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；A2第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；B1第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；B2第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；C1第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；C2第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；1.1计算系数；d 稀释因子（第一稀释度）。6 试验结果与报告6.1 结果判定（1）形态和染色反应符合葡萄球菌特征，血浆凝固酶阳性，报告“发现致病性葡萄球菌”。（2）形态和染色反应符合葡萄球菌特征，血浆凝固酶阴性，报告“发现非致病性葡萄球菌”。6.2 报告要求列表记录实验过程中各步骤结果，并据此做出结论。7 思考题为什么采用血浆凝固酶试验来决定葡萄球菌致病和不致病？-第 4 页-