注射液无菌检查的方法学验证方案.docx
注射液无菌检查方法（中国药典2022版）验证方案验证方案编号：2022MEF04105004起草单位(Composed by)： 质检部(QC Department)日期（Date）：日期（Date）：审核人(Reviewed by QC)：日期（Date）：审核人(Reviewed by QA)：日期（Date）：批准人(Approved by)：日期（Date）：起草人（Composer）：1 .验证目的2 .验证人员3 .验证依据及参考文件4 .仪器与设施5 .验证过程5.1 培育基及稀释液5.2 菌液的培育与制备5.3 方法验证试验6 .验证总结L验证目的：本试验是注射液的抑细菌、抑真菌活性及所用的无菌检查方法的牢靠性进行 验证，以确认该产品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充 分消退至可以忽视。即：保证所用的无菌检验方法能对该产品进行精 确、牢靠的检验。2 .验证人员：验证小组组长：刘长宏验证小组副组长：宋芳良验证小组成员：曲晓燕、常西胜3 .验证依据及参考文件：验证依据：中华人民共和国药典2022版二部参考文件：2022年版中国药典无菌检查方法、验证操作学习班讲稿汇编（中国 药品检验所）4 .仪器与设施型机动门脉冲真空灭菌器细菌培育箱霉菌培育箱净化工作台5 .验证过程：5.1 培育基及稀释液培育基及稀释液的配制按“中国药典2022版二部附录XI H无菌检查法”中，有关规定配制本验证 所需培育基：名称来源生产批号配制批号硫乙醇酸盐流体培育基改良马丁培育基养分肉汤培育基养分琼脂培育基0.1%蛋白陈溶液0.9%无菌NaCl溶液改良马丁琼脂培育基培育基的适用性检验.1培育基无菌性检查从以上培育基及稀释液中，每批随机取5支（瓶），培育14天，应无菌生长。结果纪录:名称1#2#3#4#5#结果硫乙醇酸盐流体培育基改良马丁培育基养分肉汤培育基养分琼脂培育基0.1%蛋白陈溶液0.9%无菌NaCl溶液改良马丁琼脂培育基注：无菌生长记为“一”；有菌生长记为“+”结论:.2培育基灵敏度检查取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培育基9支，分别接种小于lOOcfu的 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌、生抱梭菌各2支，另1支不接 种作为空白比照，培育3天，逐日观看结果。取每支装量为9ml的改良马丁培育基5支,分别接种小于lOOcfu的白色念 珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白比照，培育5天，逐日观看结果。空白比照管应无菌生长，假设加菌的培育基管均生长良好，那么可判该培育基的 灵敏度检查符合规定。硫乙醇酸盐流体培育基批号：菌液名称第一其次天第三天金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌生抱梭菌空白比照注：无菌生长记为“一”；有菌生长且生长良好记为“ 十 ”；有菌生长但生长 较差记为“差二改良马丁培育基批号:菌液名称第1天第2天第3天第4天第5天白色念珠菌黑曲霉空白比照注：无菌生长记为“一”；有菌生长且生长良好记为“ + ”；有菌生长但生长较差 记为“差二结论:5.2 菌液的培育与制备 菌种菌种名称编号批号代数金黄色葡萄球菌CMCC (B) 26003铜绿假单胞菌CMCC (B) 10104枯草芽抱杆菌CMCC (B) 63501生抱梭菌CMCC (B) 64941白色念珠菌CMCC (F) 98001黑曲霉CMCC (F) 98003菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌的新奇培育物至养分肉 汤培育基中,3035培育1824小时。用0.9%无菌NaCl溶液制成每1ml含 菌数小于lOOcfu的菌悬液。取肉汤培育物lml+9ml0.9%无菌NaCl溶液，十倍 稀释至IO-1()-7稀释级可得约为50io0cfu/ml的菌悬液。用养分琼脂培育基 做活菌计数备用。接种生抱梭菌的新奇培育物至硫乙醇酸盐流体培育基中，3035培育 1824小时。用0.9%无菌NaCl溶液稀释至10=10-7稀释级制成每 含菌 数小于lOOcfu的菌悬液。接种白色念珠菌的新奇培育物至改良马丁培育基中，2328C培育2448小 时。用0.9%无菌NaCl溶液制成每1ml含菌数小于lOOcfu的菌悬液。取改良马 丁培育物lml + 9ml0.9%无菌NaCl溶液，十倍稀释至10一5需刀稀释级可得约 为50100cfu/ml的菌悬液。用改良马丁琼脂培育基做活菌计数备用。接种黑曲霉的新奇培育物至改良马丁琼脂培育基斜面培育基中，2328培 育57天，加入35ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌NaCl溶 液，将抱子洗脱。然后，吸出抱子悬液至无菌试管中，用含0.05% (ml/ml)聚 山梨酯80的0.9%无菌NaCl溶液制成每1ml含抱子数小于1 OOcfu的抱子悬液。 取培育物lml + 9ml0.9%无菌NaCl溶液(含0. 05% (ml/ml)聚山梨酯80)十 倍稀释至IO-稀释级可得约为50loocfu/ml的泡子悬液。用改良马丁琼脂培育 基做活菌计数备用。菌液制备后在常温下放置，并在2小时内使用。假设保存在 2-8,可在24小时使用。菌种名称试 验 次 数培育温 度培育时 间/小 时活菌计数结果 cfu/ml空白对 比平皿 cfu/ml平皿1平皿2金黄色葡萄球菌130-35 48 h23铜绿假单胞菌130-35 48 h23枯草芽抱杆菌130-35 48 h23白色念珠菌123-28 72 h23黑曲霉123-28 72 h23生抱梭菌130-35 48 h23注：生抱梭菌只纪录生长状况“正常”“特别”，不计数。结论：5.3 方法验证试验按中国药典2022版二部规定，依据下表中预定检验方案，将规定量的注射 液供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最终一次的冲洗液中分别加入小于lOOcfu 的试验菌之一，过滤。取出滤膜接种至相应培育基中（金黄色葡萄球菌、铜绿假 单胞菌、枯草芽抱杆菌、生抱梭菌接种于硫乙醇酸盐流体培育基中；白色念珠菌、 黑曲霉接种于改良马丁培育基中）。另取一装有同体积培育基的容器，加入等量 的相应试验菌，作为比照。按规定温度培育35天，观看各试验管生长状况。 各试验菌同法操作。方法稀释液冲洗量产品名称膜滤 薄过法0.1 %蛋白 膝溶液0ml苦参素氯化钠注射液、法莫替丁氯化钠注射液、 胞磷胆碱钠氯化钠注射液、维生素C注射液、 胞磷胆碱钠注射液、利巴韦林注射液、肌昔注射 液、此拉西坦注射液、曲克芦丁注射液、复方氨 林巴比妥注射液、盐酸奈福泮注射液、酚磺乙胺 注射液、苦参素注射液、氢化可的松注射液、尼 莫地平注射液、维生素B6注射液、葡萄糖酸睇 钠注射液、盐酸曲马多注射液、甲硫胺酸VBi 注射液、乙酰胺注射液、盐酸曲马多氯化钠注射 液、磷酸川与嗪注射液、盐酸纳洛酮注射液、果 糖二磷酸钠注射液100ml地塞米松注射液800ml克林霉素磷酸酯注射液、硫酸小诺霉素注射液、 硫酸妥布霉素注射液、硫酸阿米卡星注射液、硫 酸庆大霉素注射液、盐酸林可霉素注射液、硫酸 奈替米星注射液PH7.0氯化 钠一蛋白陈 缓冲液无直接 接种 法X无与比照管(只加阳性菌)相比拟，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好, 那么该供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽视不计， 可以照此检查法进行该产品的日常无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，那么该供试品的该 检验量在该试验条件下有抑菌作用，可逐一采纳以下方法消退或减小该供试品的 抑菌性并重新进行方法验证：(1)增加冲洗量(2)增加培育基的用量(3)使用中和剂或灭活剂(4)更换滤膜品种同法每个注射液产品至少平行测定三次。第一次试验结果:品名：批号：规格：接种量：冲洗量：稀释液：菌种名称结果纪录种类1天2天3天4天5天金黄色葡萄球菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）铜绿假单胞菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）枯草芽狗杆菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）生抱梭菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）白色念珠菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）黑曲霉供试品+阳性菌阳性菌（比照）注：试验管无菌生长记为“一”；有菌生长且生长良好记为“+”；有菌生长但生长状况较差记为“差二其次次试验结果:品名：批号：规格:接种量：冲洗量：稀释液：菌种名称结果纪录种类1天2天3天4天5天金黄色葡萄球菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）铜绿假单胞菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）枯草芽狗杆菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）生狗梭菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）白色念珠菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）黑曲霉供试品+阳性菌阳性菌（比照）注：试验管无菌生长记为“一”；有菌生长且生长良好记为“十”；有菌生长但生长状况较差记为“差二第三次试验结果:品名：批号：规格：接种量：冲洗量：稀释液：菌种名称结果纪录种类1天2天3天4天5天金黄色葡萄球菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）铜绿假单胞菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）枯草芽泡杆菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）生相梭菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）白色念珠菌供试品+阳性菌阳性菌（比照）黑曲莓供试品+阳性菌阳性菌（比照）注：试验管无菌生长记为“一”；有菌生长且生长良好记为“+”；有菌生长但生长状况较差记为“差二结论:6 .验证总结:
