中药中黄曲霉毒素的检测讲稿.ppt

关于中药中黄曲霉毒素的检测第一页，讲稿共三十九页哦目录目录真菌毒素简介真菌毒素简介黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素现有检测方法介绍黄曲霉毒素现有检测方法介绍黄曲霉毒素检测药典收载情况黄曲霉毒素检测药典收载情况药典检测方法详解药典检测方法详解注意事项及实验室建议注意事项及实验室建议第二页，讲稿共三十九页哦真菌毒素简介真菌毒素简介真菌毒素真菌毒素：由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的：由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物，由真菌菌核产生。有毒代谢产物，由真菌菌核产生。Mycotoxin：源于希腊语（：源于希腊语（Mykes）和拉丁语）和拉丁语（Toxicum）第三页，讲稿共三十九页哦常见真菌毒素分类常见真菌毒素分类真菌种类真菌种类所产毒素所产毒素曲霉属曲霉属黄曲霉毒素、赭曲霉毒素黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A镰刀菌属镰刀菌属玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、呕吐毒素、呕吐毒素、伏马毒素毒素、伏马毒素青霉属青霉属展青霉素、桔青霉素展青霉素、桔青霉素第四页，讲稿共三十九页哦真菌毒素监控意义真菌毒素监控意义真菌毒素对食品安全的危害真菌毒素对食品安全的危害真菌毒素对种、养殖业的危害真菌毒素对种、养殖业的危害真菌毒素对制药行业的危害（中药）真菌毒素对制药行业的危害（中药）国际贸易中作为技术壁垒国际贸易中作为技术壁垒在国际反恐和战争中，真菌毒素可作为大规模杀伤在国际反恐和战争中，真菌毒素可作为大规模杀伤性生化武器性生化武器第五页，讲稿共三十九页哦黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的次生黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的次生代谢产物代谢产物第六页，讲稿共三十九页哦黄曲霉毒素的发现黄曲霉毒素的发现1960年，在英国东南部一些农场中，有大约年，在英国东南部一些农场中，有大约10万只火鸡万只火鸡不明原由地突然死亡。不明原由地突然死亡。1961年发现火鸡饲料中混有的花生粉能够使大鼠诱发年发现火鸡饲料中混有的花生粉能够使大鼠诱发肝癌。肝癌。1962年，研究发现花生粉中含有一种荧光物质是年，研究发现花生粉中含有一种荧光物质是导致。火鸡死亡的病因，这种荧光物质被证实为导致。火鸡死亡的病因，这种荧光物质被证实为黄曲霉的代谢产物，故命名为黄曲霉的代谢产物，故命名为“黄曲霉毒素黄曲霉毒素(Aflatoxins)”。第七页，讲稿共三十九页哦存在极其广泛存在极其广泛主要存在于土壤，动植物及各种坚果中。家庭自制发酵主要存在于土壤，动植物及各种坚果中。家庭自制发酵食品等也经常发现黄曲霉毒素。食品等也经常发现黄曲霉毒素。一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。检出率比较高。未能及时晒干或储藏不当的粮食容易产生，在农作物未能及时晒干或储藏不当的粮食容易产生，在农作物正常的生长期中也可以形成。正常的生长期中也可以形成。第八页，讲稿共三十九页哦毒性极强毒性极强1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌）的癌症研究机构（症研究机构（IARC）划定为）划定为类致癌物，是一种毒性类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，仅次肉毒毒素，是目前已知霉菌极强的剧毒物质，仅次肉毒毒素，是目前已知霉菌中毒性最强的。中毒性最强的。急性毒性：比氰化钾大急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大倍，比砒霜大68倍倍慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏死、慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。度的病变。第九页，讲稿共三十九页哦中药中容易产生黄曲霉毒素的品中药中容易产生黄曲霉毒素的品种种种子、果实、粮谷类中药材种子、果实、粮谷类中药材发酵类中药材发酵类中药材动物类中药材动物类中药材油性成分多的中药材油性成分多的中药材含上述种类药材的中成药含上述种类药材的中成药第十页，讲稿共三十九页哦黄曲霉毒素的种类及性质黄曲霉毒素的种类及性质根据在紫外线照射下产生荧光颜色的不同，分根据在紫外线照射下产生荧光颜色的不同，分为为B族族和和G族族两大类及其衍生物两大类及其衍生物蓝色荧光蓝色荧光黄绿色荧光黄绿色荧光第十一页，讲稿共三十九页哦化学结构化学结构基本结构：是一组化学结构类似的基本结构：是一组化学结构类似的二呋喃香二呋喃香豆素豆素的衍生化合物的衍生化合物目前发现约目前发现约20余种余种，已分离鉴定出，已分离鉴定出12种：种：B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。和毒醇。B1：最常见、毒性及致癌性最强：最常见、毒性及致癌性最强第十二页，讲稿共三十九页哦化学结构式化学结构式第十三页，讲稿共三十九页哦理化性质理化性质黄曲霉毒素相对分子量黄曲霉毒素相对分子量312346难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚但不溶于石油醚、己烷和乙醚在中性及酸性溶液中较稳定，但在在中性及酸性溶液中较稳定，但在pH为为13的强酸性的强酸性溶液中稍有分解，在溶液中稍有分解，在pH为为910的的碱性溶液中分解迅碱性溶液中分解迅速速第十四页，讲稿共三十九页哦纯品为无色结晶纯品为无色结晶耐高温，黄曲霉毒素耐高温，黄曲霉毒素B1的分解温度为的分解温度为268紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性第十五页，讲稿共三十九页哦黄曲霉毒素现有检测方法介绍黄曲霉毒素现有检测方法介绍薄层层析法：灵敏度低，定量困难薄层层析法：灵敏度低，定量困难HPLC-紫外检测法：不衍生，灵敏度低，采用紫外检测法：不衍生，灵敏度低，采用UPLC可以增强灵敏度可以增强灵敏度HPLC-荧光检测法：需衍生，灵敏度高荧光检测法：需衍生，灵敏度高高效液相色谱高效液相色谱-串联质谱法：不需衍生，灵敏度高，假串联质谱法：不需衍生，灵敏度高，假阳性少，成本高阳性少，成本高第十六页，讲稿共三十九页哦免疫化学分析方法免疫化学分析方法 酶联免疫吸附法：酶联免疫吸附法：快速、简便、单一毒素、假阳多快速、简便、单一毒素、假阳多 免疫亲和柱免疫亲和柱-荧光分光光度法荧光分光光度法：高效、无毒、假阳多：高效、无毒、假阳多 微柱筛选法微柱筛选法：半定量，测总量：半定量，测总量 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法：快速、现场大：快速、现场大批量初筛批量初筛第十七页，讲稿共三十九页哦黄曲霉毒素检测药典收载情况黄曲霉毒素检测药典收载情况2005年增补本附录年增补本附录 第一次增加了黄曲霉毒素测定法第一次增加了黄曲霉毒素测定法2010年版一部年版一部 正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、胖大海品种正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、胖大海品种项下增加了黄曲霉毒素残留量检查项下增加了黄曲霉毒素残留量检查 附录：继续收载了黄曲霉毒素测定法附录：继续收载了黄曲霉毒素测定法第十八页，讲稿共三十九页哦2010年版一部第二增补本年版一部第二增补本修订了附录方法修订了附录方法 删除了流速规定删除了流速规定增订了另一种衍生方法：即光化学衍生法增订了另一种衍生方法：即光化学衍生法 取消了免疫亲和柱的品牌规定取消了免疫亲和柱的品牌规定2015年版四部通则年版四部通则2351黄曲霉毒素测定法黄曲霉毒素测定法 增加了第二法：高效液相色谱增加了第二法：高效液相色谱-串联质谱法串联质谱法 增加附注：增加附注：“当测定结果超出限度时，采用第二法进行确当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认认”第十九页，讲稿共三十九页哦2015年版四部通则增加年版四部通则增加中药中真菌毒素测定指导原则中药中真菌毒素测定指导原则 基本原则（中药中真菌毒素的分类、监控品种、测定方法、基本原则（中药中真菌毒素的分类、监控品种、测定方法、限值拟定）限值拟定） 基本内容（高效液相色谱法、高效液相色谱基本内容（高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法）质谱联用法）第二十页，讲稿共三十九页哦2015年版四部通则年版四部通则9302 中药有害残留物限量制定中药有害残留物限量制定指导原则指导原则中关于黄曲霉毒素的规定中关于黄曲霉毒素的规定 “由于黄曲霉毒素毒性强，目前国际上由于黄曲霉毒素毒性强，目前国际上不建议设定黄不建议设定黄曲霉毒素的安全耐受量和无毒作用剂量曲霉毒素的安全耐受量和无毒作用剂量，也无最大限，也无最大限量理论值计算公式，限量越低越好量理论值计算公式，限量越低越好”。第二十一页，讲稿共三十九页哦中国药典中国药典20152015年版正文收载品种年版正文收载品种根及根茎类：远志根及根茎类：远志果实种子类：大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君果实种子类：大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟郎、酸枣仁、薏苡子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟郎、酸枣仁、薏苡仁仁动物类：僵蚕、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣动物类：僵蚕、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣共共19种种，较，较2010年版药典年版药典增加增加14种种第二十二页，讲稿共三十九页哦黄曲霉毒素药典检测方法详解黄曲霉毒素药典检测方法详解液相条件：液相条件：C18，甲醇，甲醇-乙腈乙腈-水（水（40:18:42）衍生方式：衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化学衍生柱后碘衍生、柱后光化学衍生混合对照品溶液的制备：混合对照品溶液的制备：液体标液液体标液（B1B2G1G2=10.310.3 ug/ml）梯度稀释）梯度稀释500倍倍第二十三页，讲稿共三十九页哦供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：15g粉末，粉末，3gNaCl，70%甲醇甲醇提取，免疫亲和柱纯化提取，免疫亲和柱纯化测定：测定： 吸取混合对照品溶液吸取混合对照品溶液5l、10l、15l、20l、25l，注入色谱仪，绘制标准曲线。吸取供试，注入色谱仪，绘制标准曲线。吸取供试品溶液品溶液20-25l，测定，测定第二十四页，讲稿共三十九页哦方法来源：方法来源：中国药典中国药典2015年版四部通则年版四部通则2351黄曲黄曲霉毒素测定法霉毒素测定法基本步骤基本步骤 提取提取 净化（活化、上样、洗杂、洗脱）净化（活化、上样、洗杂、洗脱） 测定测定 随行质量控制（质控样、随行加样回收）随行质量控制（质控样、随行加样回收）第二十五页，讲稿共三十九页哦泵流操作架泵流操作架免疫亲和柱免疫亲和柱HPLC-荧光检测器荧光检测器光化学衍生器光化学衍生器自动固相萃取仪自动固相萃取仪第二十六页，讲稿共三十九页哦净化步骤净化步骤取取15ml（离心后的提取液），加水至（离心后的提取液），加水至50ml滤过，取滤过，取20ml，通过免疫亲和柱，通过免疫亲和柱，流速流速3ml/min加水洗涤两次，每次加水洗涤两次，每次10ml过空气过空气10秒，将水挤出柱子秒，将水挤出柱子分次加甲醇分次加甲醇1.5ml，自然洗脱，过空气，定容至，自然洗脱，过空气，定容至2ml第二十七页，讲稿共三十九页哦免疫亲和柱的原理免疫亲和柱的原理利用利用抗原抗体免疫反应抗原抗体免疫反应的原理，使用大剂量的单的原理，使用大剂量的单克隆抗体，选择性的将样克隆抗体，选择性的将样品提取液中的黄曲霉毒素品提取液中的黄曲霉毒素吸附，用水将杂质洗脱除吸附，用水将杂质洗脱除去，再用甲醇定量将黄曲去，再用甲醇定量将黄曲霉毒素洗脱，达到分离净霉毒素洗脱，达到分离净化目的化目的黄曲霉毒素黄曲霉毒素单克隆抗体单克隆抗体杂质杂质第二十八页，讲稿共三十九页哦黄曲霉毒素的衍生化黄曲霉毒素的衍生化衍生原因衍生原因 黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1、G1荧光遇水要淬灭荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化，检测前需要衍生化第二十九页，讲稿共三十九页哦药典附录收载的两种衍生方法药典附录收载的两种衍生方法 碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有要求，试剂碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有要求，试剂对仪器有腐蚀性，需要冲洗对仪器有腐蚀性，需要冲洗 光化学衍生法：紫外光灯（光化学衍生法：紫外光灯（254nm ）照射，操作简）照射，操作简单，对衍生温度无要求，不需要其他衍生剂，无单，对衍生温度无要求，不需要其他衍生剂，无需冲洗需冲洗 对黄曲霉毒素对黄曲霉毒素B1和和G1进行衍生进行衍生，黄曲霉毒素，黄曲霉毒素B2和和G2不受该衍生步骤的影响不受该衍生步骤的影响第三十页，讲稿共三十九页哦AFB1AFG1黄曲霉毒素的衍生化黄曲霉毒素的衍生化第三十一页，讲稿共三十九页哦黄曲霉毒素的衍生化黄曲霉毒素的衍生化第三十二页，讲稿共三十九页哦结果报告结果报告低于检测限（标低于检测限（标出检测限）出检测限）报告具体值报告具体值未检出未检出限度内限度内限度外限度外报告具体值报告具体值第三十三页，讲稿共三十九页哦方法难点方法难点痕量分析痕量分析ppb级，要求高灵敏度级，要求高灵敏度毒性强，具有一定的风险性毒性强，具有一定的风险性安全防护措施安全防护措施基质复杂基质复杂第三十四页，讲稿共三十九页哦注意事项注意事项取样的代表性取样的代表性 黄曲霉毒素在样品中分布不均匀黄曲霉毒素在样品中分布不均匀免疫亲和柱的使用免疫亲和柱的使用 储存、使用温度（使用说明书）储存、使用温度（使用说明书）安全防护安全防护 操作人员专门培训，全程穿工作服佩戴手套操作人员专门培训，全程穿工作服佩戴手套注意事项及实验室建议注意事项及实验室建议第三十五页，讲稿共三十九页哦对照品的使用对照品的使用 使用黄曲霉毒素混合对照品使用黄曲霉毒素混合对照品，不使用黄曲霉毒素固，不使用黄曲霉毒素固体纯品自行配置体纯品自行配置 对照品贮备液避光、低温、密闭保存，对照品贮备液避光、低温、密闭保存，工作液现配现工作液现配现用用第三十六页，讲稿共三十九页哦试验废弃物处理试验废弃物处理 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应泡在专残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应泡在专用贮存容器（含用贮存容器（含10%次氯酸钠溶液内，次氯酸钠溶液内，浸泡浸泡24小时小时以以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净）上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净） 流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常规处理流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常规处理第三十七页，讲稿共三十九页哦实验室的建议实验室的建议专门的仪器设备和场所专门的仪器设备和场所安全措施安全措施废弃物废弃物第三十八页，讲稿共三十九页哦感谢大家观看第三十九页，讲稿共三十九页哦