凝血实验的标准化和质量控制问题.doc

凝血实验标准化和质量控制问题由于血栓和止血实验特殊性，故迄今为止仅有凝血酶原时间（prothrombin time, PT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time, APTT）和纤维蛋白原(fibrinogen,FG) 等三项实验有了标准化试剂（如PT）、标准品（如Fg）、质控品和统一报告形式等，其他，如血小板功能、抗凝因子和纤溶因子等检测尚缺乏成熟标准化方案。本文就经国际血液学标准化委员会（ICSH）和国际血栓和止血委员会 (ICTH) 或美国国家临床生化室标准委员会 (NCCLS) 等国际组织以文件形式公布PT、APTT和Fg三项实验标准化和质量控制问题作一简介。一、 标准化和质量控制重要性 所谓血栓和止血检测方法质量控制（质控），是指采用统计学原理，运用物理、化学、生物学方法，对血栓和止血实验室技术、操作、仪器、试剂等项质量水平，进行合理检测、评价和指导改进，以堵绝误差，提高质量而言。 血栓和止血实验质控目，在于提高血栓和止血实验可靠性。可靠性首先取决于检测结 果精密度（主要靠实验室内部质控保证），其次取决于检测结果准确度（主要靠实验室 外部质控保证）。质量控制重要性在于：1. 为临床诊治提供可靠依据# 实验结果若为假阳性就会造成误诊、误治；若为假阴性就会造成漏诊、漏治；实验结果偏高或偏低都会影响患者病情和疗效判断。2. 提高血栓和止血基础研究效率和价值# 血栓和止血基础研究形式就是进行各种实验。实验可靠性好，就能揭示血栓和止血客观规律，甚至可带来重大理论突破及（或）社会、经济效益；若实验可靠性差或有错误，则不仅费时、费力，徒劳无功，还会造成假象或错误理论。3. 有助于人群健康调查和建立血液学参数正常范围# 为了解一定人群健康水平，建立具有广泛意义血液学参考值范围须进行较大规模人群健康调查，健康调查必须要有实验结果可靠性作保障，不然会导致不准确或错误结果，故质量控制对群体医学也有重要意义。 总之，血栓和止血实验室质量控制，从一定程度上反映一个国家，一个地区，一个单位血栓和止血医疗水平和研究水平高低。因此，应倍加重视。二、 凝血酶原时间（PT）（一）PT标准化问题自从1953年Quick建立了PT测定方法以来，至今仍然是检查外源凝血系统诸因子及相关抑制物重要筛选试验，并且是监测口服抗凝药治疗主要手段。PT测定受很多因素影响，诸如标本采集方法及器材，储血容器性质，抗凝剂种类和用量，标本运送和储存条件，孵育温度及时间，凝血活酶试剂种类和质量（敏感性）以及判读终点方法等，均会影响测定结果。此外，报告结果方式也必须统一，特别是用于监测口服抗凝药物治疗时。所有这一切，都必须使方法标准化和建立有效质量控制。早在1973年，在维也纳召开第四届血栓和止血国际会议上，由ICSH和ICTH联合成立了口服抗凝药控制专家组（Expert Panel on Oral Anticoagulant Control），要求该组制订推荐一个PT测定标准化方案。经过多个实验室协作研究，在1975年该专家组提出了第一个人血一期凝血酶原时间试验参考方法（reference method for the one-stage prothrombin time test on human blood）并于1976年发表（编号ICSH-EP14/1：1975）。该文件重点是讲标本采集和PT测定方法，对于报告结果和质量控制只简单地提了几句。而至关重要PT试剂凝血活酶标准化问题，当时虽然注意到，但因条件尚未成熟，仅答应进一步研究完成后再修订。众所周知，不同凝血活酶，检测相关凝血因子缺乏敏感性是不同。因此要使PT标准化，使不同实验室虽用了不同凝血活酶，也能得到同样（可比）结果。此后，经过几个著名实验室历时数年共同努力，并由世界卫生组织（WHO）参和，以当时已在英国作为统一标准使用“英国比较凝血活酶”（british comparative thromboplastin, 简称BCT）为基础，制备了WHO原级凝血活酶参考品 (primary reference preparation) 人脑制品，编号67/40；同时制备了牛脑 （68/434）和兔脑（70/178）两个用67/40标化次级参考品（secondary reference preparation）。后来，WHO又发表了其他一些次级参考品，迄今已在世界各国广泛用于校正本地制备或工厂生产PT参考物。和此同时，在口服抗凝药物治疗中，用PT监测时报告方式也列入了议事日程。如上所述，各种凝血活酶对凝血因子有不同敏感性。为了使不同敏感性试剂得到同样测试结果，首先要制定一个共同敏感性指标。这就要通过用自制试剂和IRP进行比较后，得到一个校正值。具体做法是：用多份口服抗凝药后不同程度地缺乏凝血因子病人血浆和正常对照（至少混合10个正常人）血浆，同时用自制凝血活酶和国际参考品（IRP）测定PT（结果用秒表示），分别计算出各自和正常对照血浆比率。然后在双对数纸上作图，以IRP比率为纵坐标，自制凝血活酶比率为横坐标，通过回归分析，其回归线斜率称为国际敏感指数（international sensitivityindex, ISI）。此数值愈低PT试剂愈低敏感（人脑制原级标准作为1.0）。从理论上讲，不管何种凝血活酶，只要标上ISI，就可以和国际参考制品进行对比校正，并可用同一种计量单位报告。1985年，ICSH和ICTH发表了在口服抗凝药监测中推荐PT报告方式(即ICSH/ICTH recommendations for reporting protrombin time in oral anticoagulant control)。该文件提出用国际标准化比率（international normalized ratio, INR）来报告PT试验结果，INR计算公式如下：INR=PTRISI式中PTR表示患者PT和正常对照PT比值；ISI为国际敏感指数。文件要求试剂厂家每批凝血活酶试剂都必须标明ISI值，以便使用者计算INR。目前各国在口服华法令类抗凝药物时，已广泛使用INR作为控制用药量指标。在用INR以后，各种敏感性不同凝血活酶均可得到相同INR值，这对于用手工法（倾斜试管法）测定PT值并用手工法测定PT来讲是正确。但后来发现，手工和仪器以及仪器和仪器之间，INR仍有差别。为此，等提出建议，同一凝血活酶试剂用于不同仪器时，可用所谓“仪器特有ISI”（instrument specific ISIs）来计算INR。WHO在发放IRP时，亦附上这种仪器特有ISI。除了ICSH、ICTH和WHO发布有关PT测定标准化文件以外，1992年美国NCCLS也发表了编号为H28-T有关PT测定标准化文件。本文以下将综和上述文件，提出我国PT测定标准化和质量控制方案，供讨论。（二） 凝血酶原时间（PT）推荐方法原理将凝血活酶（主要含组织因子和脂质）和钙离子，加到枸橼酸抗凝血浆中，在37º保温，测定血浆凝固时间，即为PT。本法主要用于过筛检测外源凝血途径第、因子和相关因子抑制物。试剂1、 抗凝剂 109mmol/L枸橼酸钠液（相当于含二分子结晶水枸橼酸钠32g/L）。2、 凝血活酶试剂 市售商品，应标有ISI、批号及有效期。冻干者应按说明书加指 定缓冲稀释剂复溶。3、 氯化钙（CaCl2）溶液 浓度为25 mmol/L。（目前有些商品试剂已将凝血活酶液和氯化钙液混合好，可不必另配CaCl2液）。4、 质控物 正常及异常对照血浆 仪器1、 手工法 秒表，保持37º±1º恒温水浴箱或电热块。2、 仪器法 各种自动或半自动凝血仪，严格按说明书操作。血液样品采集、运送及储存1、 用一次性塑料采血器或硅化玻璃注射器。采血时止血带不可束缚过紧，并不应超过 5分钟（针筒内见到血即应解开止血带）。否则某些凝血及纤溶因子会活化，并可能 使Hct长高。2、 血和枸橼酸钠抗凝剂按9:1 混合，轻轻颠倒混匀。可用特制已加有定量枸橼酸钠液抽空硅化试管（国内已大量生产）采血，可保证血和枸橼酸钠比例准确，防止凝血因子活化，并保持清洁，防止试管和不合格橡皮塞污染。 血液如发现凝固即应弃去不用，也不可污染组织液。3、 储血应用塑料管或硅化试管（国内已有商品大量供应）或其他不沾湿容器，避免接触活化凝血因子。取得血液后应尽快送到血液检验室。在运送中应避免剧烈振动和日光直射。一般要求，自采血到测定在2小时内完成，不可久储。如在室温中储存过久，第因子等会破坏；另一方面，冷冻或在4º储存过久，会导致第因子活化，使PT缩短。有报道有些口服抗凝药患者，全血在4º储存2-4小时，其PT可接近正常。故实验室在取得血样后应尽快离心，分离血浆并尽快测定。4、 标本制备：PT和APTT都应用乏血小板血浆（PPP），分离血浆时要求相对离心力20002500×g，离心30分钟，用浊度法测定终点自动化凝血仪，溶血和较明显黄疸及脂血均会影响结果，此时可用手工法或电子机械式凝血仪测定。 测定步骤：1、 手工法（1） 测定温度36.538.5ºC，上述各试剂及被测血浆，均应预温至此一温度，但凝血活酶 试剂预温不可超过30分钟，血浆预温一般不宜超过10分钟。（2） 所用试管及加样器等接触血浆器具均为塑料或硅化玻璃管。（3） 吸取枸橼酸抗凝血浆0.1ml，加入一小试管中：加入凝血活酶试剂0.1ml混匀后置 37ºC 水浴中。再加入25mmol/L CaCl2液0.1ml，（也可先将凝血活酶试剂和CaCl2溶液 等量 混合，加入0.2 ml）。立即混匀并开动秒表：试管仍浸于水浴中，至约10秒钟时， 自水浴中取出，在纱布上迅速擦去试管外水滴，在明亮处不断倾斜试管，在流动状态 下观察有无纤维蛋白形成。一旦见到纤维蛋白（同时将出现液体流动减慢），立即停表， 记录时间。每次测定二管，按平均数报告。 本试验最后混合液其PH应为7.27.3，大部分商品凝血活酶试剂均用含缓冲液 溶液配制。（4） 每批均同时做正常和异常对照，方法应和测定标本完全相同。 2、仪器法凝血测定仪大体可分为光电浊度法和电子机械法两大类，自动化程度也不一 样。一般仪器均供应配套试剂，各有详细说明书，应严格按说明书操作。报告方式1、 以PT秒（S）数报告（最接近0.5秒）2、 以患者血浆PT（S）/正常对照PT（S）比率（PRT）报告。3、 在口服华法令类抗凝药物治疗监控时，应报告国际标准化比率，INR。大部分自动化化仪器可根据所测PTR和凝血活酶试剂ISI，自动算出INR。手工法可根据下列公式，用一计算器直接计算： INR=PTRISI INR=Antilog(ISI × logPRT)Poller设计了一个简便列线图，在取得PTR和ISI值后，即可从图上直接查找出INR值，十分便利，国内已有介绍。ICSH规定，不再用稀释曲线或百分比（活动度）报告。参考值因仪器/试剂不同，会得出不同结果，故很难统一规定参考值。各实验室应根据自己仪器、试剂等条件，自行测定一批健康人，建立参考值。此后至少每年或当条件有变化时，根据新条件，重新建立。PT测定一切条件均应和患者血浆PT测定相同（包括采血、容器、抗凝剂等）。健康供血者应选至少20个1855岁男性和非妊娠、月经期女性，不可服药，在平静休息状态采血，以减少个体差异（有条件时，可测一批老年人和小儿，分开统计）。同时应分开几天采血和测定，以减少天间差异。测定结果经统计学处理，计算标准差：以两个标准差（2SD）或95%可信限作为参考范围。对于三个标准差是正常还是异常，需结合具体情况进行评估。从统计学上讲，其中有些人是正常。用以上标准，病人（PT异常）则很少会遗漏。三、活化部分凝血活酶时间（APTT）（一） APTT标准化问题 APTT是检测内源凝血系统诸凝血因子缺陷和相关抑制物筛选试验，也是当前用于凝血因子治疗、肝素抗凝治疗以及狼疮抗凝物质检测主要手段。和PT测定一样，不同部分凝血活酶、不同活化剂和不同激活时间对各种凝血因子缺陷、对肝素和对狼疮抗凝物质敏感性相差很大。例如，检测APTT试剂中，所用活化剂（白陶土、硅藻土、鞣花酸）不同，他们对检测肝素、狼疮抗凝物质和因子、敏感性不同，见表1。表1 不同活化剂对检测物敏感性比较 APTT试剂 对因子敏感性 对肝素敏感性对狼疮抗凝物质敏感 性 硅藻土+ + 白陶土+ + 鞣花酸+迄今，ICSH和ICTH尚未有APTT检测标准化或试剂标准化可行方案问世，仅NCCLS于1992年，提出一个编号为H29-T暂行方案。（二）活化部分凝血活酶时间（APTT）推荐方法原理 将一种磷脂和激活剂加到血浆中，经过孵育后，加入适当浓度钙离子。其纤维蛋白凝块形成时间（以秒计），即为APTT。本法主要用于过筛测定内源途径凝血因子和共同途径因子缺陷，如因子XII、VIII、IX、PK、HMWK以及纤维蛋白原等。同时也用于上述因子抑制物测定、肝素治疗监测以及狼疮抗凝因子检查。仪器 本法所用仪器、设备（包括采血、贮血容器、加样装置等）以及对它们要求完全和PT相同。PT所用自动化仪器同样适于本法。试剂 1、部分凝血活酶试剂（一种脑磷脂）由商品供应，一般已和激活剂按比例配在一起（或分开配制），常用激活剂由硅藻土（商品名Celite）、白陶土、二氧化硅微粒、鞣化酸（ellagic acid）或其它可用激活剂，由厂方配套供应。APTT试剂/仪器结合，应能使第VIII、IX或XI因子活性低于0.3u/ml（或<30%）血 浆，出现异常延长结果。2、 氯化钙溶液（25mmol/L）以及其它试剂和PT所用者相同。测定步骤1、样品采取、贮存、运送和PT测定同。注意，应用清洁塑料或硅化玻璃采血器采血及贮血。2、标本（去血小板血浆）制备和PT同。注意，应用去血小板血浆测定。3、水浴箱或电热板温度为37±1ºC，要经常检查是否正确。4、接触活化时间：加激活剂活化XII因子时间要保持一致。各仪器和试剂生产厂家规定可能不一样，应严格按说明书要求进行。手工操作时，应用秒表或类似定时装置计时。5、操作 预温（不超过30分钟）APTT试剂一份和预温（不超过10分钟）待测血浆一份混合，立即开动秒表计时。至规定接触活化时间终点时，加入预温37ºCC aCl2液一份，混匀，同时开动秒表。至出现血浆凝固时，停表，记录血浆凝固时间（以秒计）。手工测定时应同时测定两管，按平均数报告。一些精密度已有很大改进自动或半自动凝血仪，如果有适当质控标准也可只测定一次。此外，应同时测定正常和异常对照血浆。 参考值参照PT 特殊解释 1、对肝素敏感性 APTT常用于肝素治疗监测，通常以患者APTT和正常血浆APTT比率在1.52.5作为治疗控制范围。但不同试剂/仪器系统对肝素敏感性不同，其试剂/仪器系统对肝素敏感性可进行测定。体外敏感性（in vitro sensitivity）是指将临床在使用同类型肝素按其治疗浓度，加到正常血浆中，测定APTT。体外敏感性和体内敏感性（in vivo sensitivity）不等同，但可作参考。 2、狼疮抗凝因子 狼疮抗凝因子是一种抗磷脂自身抗体，由于它抗凝血重要成分磷脂，故能干扰凝血。血中如存在狼疮抗凝因子，APTT将延长。但APTT试剂对狼疮抗凝因子敏感或不敏感有很大差别，试剂制造厂家应提供足够说明,有关国家机构也可提供对狼疮抗凝因子第三性差异资料.但要知道,病人个体之间也有很大差异(杂合性),没有一种试剂能测出所有狼疮抗凝因子。 四、纤维蛋白原测定（Fg）（一）Fg标准化问题 纤维蛋白原（Fg）由肝合成，存在于血浆和体液中，其结构和功能基本已搞清，但迄今仍无联系临床检测方法.文献报道测定方法多至10余种,有精密度、准确性较好，但过于复杂、烦琐；有虽然简便、快速，但精密度、准确性较差。 1992年英国国家生物标准及控制研究所（NIBSC），研究完成了一个纤维蛋白原标准品，编号为89/644，向WHO生物标准专家委员会（ECBS）推荐，15并被ECBC批准为国际参考品（IRP）。从此，各国均引进这一标准品来标化本国或工厂生产次极标准品（我国卫生部临床检验 中心亦已在引进）。使纤维蛋白原测定标准化工作，走出了关键一步。因此根据以往调查，各家标准品纤维蛋白含量互相差别很大，有竟相差达200%！（二） 纤维蛋白原（Fg）测定推荐方法 各家用IRP来标化自己标准时，推荐采用Jacobsson改良法，现将该法介绍如下。 试剂1、缓冲液 N a22H2O 0.882g; KH2PO4 2.77g加水至1L，此为贮存液；将贮存缓冲液1份，加生理盐水2份即为应用缓冲液，PH为6.35。2生理盐水 0.15mol/L3.人或牛凝血酶 500IU/ml，生理盐水溶液。4.凝块溶解剂 尿素400g溶于少量蒸馏水中，200ml 1.0mol/L NaOH,再加水至1L。操作 将纤维蛋白原冻干（标准）品（源于89/644）加1 ml蒸馏水复溶，加到含有2 ml应用缓冲液有机玻璃浅盘或其他容器中，再加入凝血酶液50l，迅速混匀，在室温中静制置2小时。将容器倒扣于吸水布上（其下可垫吸水纸），再用适当物质（如滤纸）将凝块吸干。将凝块取下，置于50 ml生理盐水中洗涤两次，每次洗涤后均应将凝块吸干（可用玻璃挤压凝块），尽量除去含于凝块中液体，以免液体中其它血浆蛋白残留。必要时可在清洁棉布上挤压。 小心将凝块加入含凝块溶解剂7.5 ml容器中，摇匀，直至凝块完全溶解后混匀。倒入光径为1cm比色杯中，以凝块溶解剂为空白，在280 nm和315 nm波长读取吸光度（A）。计算 纤维蛋白原浓度（g/L）=（A280A315）×7.5/15.87=( A280A315) ×0.47式中15.87为纤维蛋白在碱性条件下波长280 nm消光系数；7.5为纤维蛋白原稀释倍数。当A在1.0以下时，吸光度和浓度呈线性关系。如A大于1.0，应稀释标本重新测定，重新乘稀释倍数。（三）适用纤维蛋白原（FG）测定（Clauss法）原理将凝血酶加到血浆中，使纤维蛋白原变成纤维蛋白，使出现凝固。在有足量凝血酶时，和不同含量纤维蛋白原作用，其出现凝固时间和纤维蛋白原含量呈负相关。试剂1、 牛凝血酶100NIH U/ml2、 纤维蛋白原标准品（IRP次级标准）3、 缓冲液（下列两种任选一种）：（1） 巴比妥缓冲液（PH7.5）；巴比妥2.5g，巴比妥钠2.75g，璐氯化钠7.3g溶于750ml去离子水中，校正至PH7.5，加水至1L。（2） 咪唑（Imidazole，或Glyoxaline）缓冲液：咪唑3.4g（0.05M），氯化钠5.85g，加于约500ml水中；加0.1mol/L盐酸186ml，调PH至7.3-7.4，最后加蒸馏水至1L。测定步骤1、 手工法（1）用上述缓冲液先将标准品稀释成0.8，1.6， 2 .4，和4.0g/L纤维蛋白原浓度。各浓度再用缓冲液作1：10稀释。（2） 患者血浆及质控物用缓冲液作1：10稀释。（3） 将含100NIHU/ml ，混匀后室温保存。 如用仪器法测定，则用100NIH U/ml ,不必稀释。（4） 在一试管中，加稀释血浆0.2ml ,置37ºC水浴中4分钟。（5） 加入预温37ºC凝血酶液0.2ml，摇匀并立即开动秒表，不断观察凝固时间。至出现凝固时停表。（6） 每份标本测定两次，求平均数。同时测定各标准管和对照（质控）管，方法相同，准确记录时间。（7） 计算： 用双对数纸作图，以凝固时间为纵坐标，纤维蛋白原浓度为横坐标，将各相应浓度标准管对凝固时间，在图上标出相应点并连成直线，制成标准曲线。然后根据患者和质控血浆所测得凝固时间，在图上查到纤维蛋白含量。 如血浆纤维蛋白含量大于4g/L，应稀释血浆后重测，结果乘以稀释倍数。 如血浆纤维蛋白含量低于0.8g/L，需将原血浆改为1：2或1：5稀释，在标准曲线 上查得结果后除以5或除以2。2、 仪器法本法可用自动或半自动凝血仪，按凝血酶时间（TT）测定法测定。可自动打印出结果。一般仪器法比手工法精密度高，尤其是在含量高时，仪器法比手工法更好。本法干扰因素主要是肝素。在高浓度时可造成假低值（可通过加入硫酸鱼精蛋白而消除）；PIVKA变可造成假低值。主要误差来源1、 血浆稀释不准确。2、 凝血酶活性不足或丢失。凝血酶一般应在低温保存，稀释后在塑料（聚乙烯）试管中4º保存，可保存活性24小时。3、 测定终点观察不准确，尤其是纤维蛋白原含量高时，往往在8秒钟左右即凝固，手工法重复性较差，不易做准。五、PT、APTT和Fg质量控制问题（一）室内控制 每天开始，（工作量大单位每40个样本一批）都必需用正常和异常对照血浆进行核对。这种血浆有商品供应，自制时正常血浆和上述参考血浆制备法相同。异常血浆则采用口服华法另类抗凝药，导致一个或一个以上因子部分缺乏，PT比正常对照延长1.5-2倍患者血液，完全按上述制备正常血浆相同条件制备，冰冻或冻干保存。但应注意，有些冻干品复融后会有混浊，影响浊度法自动血凝仪测定。如发现有出控现象（超过原标定平均数+2SD），应逐一检查仪器、试剂和质控血浆有无问题并加以校正。否则不能发出报告。目前尚无PT血浆标准品，上述对照（质控）血浆主要供各实验室自己核查、 校对之用。（二）可接受变异性（acceptable variability） 对于同一批质控血浆，分析系统中试剂、仪器、加（取）样装置以及定时器等总天和天之间变异系数（不精密度）CV不得超过5%。（三）重复实验变异系数（coefficient of variation for replicate test） 同份标本测定两次（下称双份测定），其差值大小，可用来评价分析系统批内精密度。正常血浆及异常（比正常延长1-2倍）血浆双份测定，其CV不应超过5%。（四）双份测定重现性（reproducibility of duplicate） 双份测定之间差值大小，通常用来作为结果可接受性标准。此点有助于核查系统不精密度和/或偶然分析误差。虽然这种由操作构成差值大小会因所用分析系统不同而有所变化，一般用双份测定之间两次测定平均差10%作为可接受标准。（五）室内质评 各实验室必需积极参加由检验中心组织室间质评活动，以便及时了解本单位PT测定准确性。虽然因仪器和试剂不同，同一份质控血浆可得到不同结果，但用手工法，同一试剂结果是一致。此外，不同类型仪器/试剂，如分开统计，也有一定可比性。故回报时，应将仪器型号和试剂厂牌及批号等附上，以供比较。 （六）造成结果错误各种原因 1、和样品（Specimen）或标本（Sample）有关问题（1） 血样收集管注入血液过多或不足。（2） 患者红细胞比积>0.55%时未校正枸橼酸盐液体积。（3） 用了不正确抗凝剂（如EDTA或草酸盐）或未加抗凝剂，或浓度不正确。（4） 用了已凝固、溶血、黄疸或脂血样品。（5） 血样混匀不当或太剧烈混匀。（6） 采血器或贮血管不洁，已受到污染。（7） 污染了肝素。 2、分析前错误 血样送验延误或用了不合规定方法运送、处理或贮存血样。 3、和试剂有关问题 （1）试剂已被污染。 （2）复溶时稀释剂加量不准确。 （3）复溶时未用推荐试剂。 （4）试剂在运输、贮存过程中，由于处理不当而变质。 （5）试剂复溶后超过了规定稳定期或试剂已超过有效期。 4、分析过程错误 如孵育时间不准确；温度、加试剂量以及仪器操作步骤不准确等。