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-土壤微生物的分离及鉴定-第 33 页微生物实验报告土壤微生物的分离筛选纯化与鉴定山东大学生命科学学院2011级生物基地（周一下午*组） 同组者： 指导老师： 时间：2012年12月9日2012年12月21日摘要利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，通过对菌落形态的观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果，通过查阅伯杰氏系统细菌学手册对照种属特征最终判断所分离纯化的细菌所属的属。关键词土壤微生物，分离鉴定，生理生化，酶活测定，伯杰氏系统细菌学手册前言土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌数减少。 通过土壤微生物的分离纯化，得到纯种，再进行相关的实验，如：菌落观察、革兰氏染色、芽孢染色、生理生化试验等，根据实验结果，查阅伯杰氏系统细菌学手册确定所分离纯化细菌所属的属。在此过程中熟悉相关操作。一 实验目的1.学会设计实验方案；2.分离目的菌，掌握几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；显微镜使用方法；配制培养基的一般方法和步骤、复习各种灭菌方法和操作步骤；5.复习、掌握细菌稀释分离、划线分离等技术。复习并掌握平板倾注 法和斜面接种技术，了解培养细菌的培养条件和培养时间。复习平板菌落计数法；6.复习掌握细菌的简单染色、鞭毛染色、革兰氏染色的基本原理和操作方法，复习霉菌的小室培养法；7.复习生理生化试验的原理及操作方法，学习测定酶活的实验方法；8.学会利用伯杰氏系统细菌学手册对所分离纯化的细菌定属。二实验原理配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。当果胶被果胶分解菌分泌的果胶酶分解后，刚果红-果胶的复合物就将无法形成，从而在培养基中形成以果胶分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选果胶分解菌。配制以几丁质为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用几丁质的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产几丁质酶的菌株。因为几丁质不能溶解于培养基，故在固体培养基平板上表现为浑浊，若菌株能够产生几丁质酶，则在培养基中形成以菌落为中心的透明圈，因此可以通过是否产生透明圈来筛选几丁质酶产生菌株。为筛选到真菌，采用加入链霉素来抑制细菌生长。通过培养的方法使肉眼看不见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个聚集在一起的肉眼可见的菌落。平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在37温度下培养，12天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。单染色即用单纯的种染料进行染色，多数采用美蓝、结晶紫或石碳酸复红等碱性染料。此法仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构。染色前必须将细胞固定，其目的是杀死细菌，并使它粘附在载玻片上。此外，还可以增加菌体对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。无论用哪种方法都应尽量使细菌维持原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂 ；脱色剂和复染液。碱性染料初染的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95 的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子（endospore），通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生部位、芽孢囊是否膨大等特征都是细菌分类的重要指标。与正常细孢或菌体相比，芽孢壁厚、透性低而不易着色，但是，芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力较强的染料（如孔雀绿或石碳酸复红）在加热条件下进行染色，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则仍然保留。再用对比度大的复染剂（如番红液）染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样就可以将两者区别开来。7. 细菌运动性检测半固体穿刺法将细菌穿刺培养于半固体培养基中，经培养后，无鞭毛的细菌沿穿刺线生长，穿刺线清晰；有鞭毛的细菌沿穿刺线向四周扩散，穿刺线模糊不清。鞭毛是细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。根据鞭毛的特征，可将有动力细菌分为单端极鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌。鞭毛直径一般为1030nm，只有用电镜才能直接观察到。在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。首先用媒染剂（如单宁酸或明矾钾）处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红（Gray氏染色法）、碱性复品红（Leifson氏染色法）、硝酸银（West氏染色法）或结晶紫（Difco氏染色法）进行染色。在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。9.霉菌的形态观察霉菌菌丝体由基内菌丝、气生菌丝和繁殖菌丝组成，其菌丝比细菌及放线菌粗几倍到几十倍。可以采取直接制片和透明胶带法观察，也可以采取载玻片培养观察法，通过无菌操作将薄层培养基琼脂置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，使菌丝体在盖玻片和载玻片之间的培养基中生长，将培养物直接置于显微镜下可观察到霉菌自然生长状态并可连续观察不同发育期的菌体结构特征变化。对霉菌可利用乳酸石炭酸棉蓝染液进行染色，盖上盖玻片后制成霉菌制片镜检。石炭酸可以杀死菌体及孢子并可防腐，乳酸可保持菌体不变形，棉蓝使菌体着色。同时，这种霉菌制片不易干燥，能防止孢子飞散，用树胶封固后可制成永久标本长期保存。10.微生物数量的测定显微镜直接计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)-显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。本实验用血球计数板进行显微镜直接计数。血细胞计数板构造如图2。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格(图1)，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3(万分之一毫升)。计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。25个中方格的计数板，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）同理，16个中方格的计数板，1mL菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A·B（个）。图1 血球计数板构造示意图11.生理生化在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。代谢过程主要是酶促反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内，称为胞内酶（endoenzymes）.许多细菌产生胞外酶(exoenzymes)，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下：（1） 大分子水解试验：微生物对大分子如淀粉、蛋白质和油脂不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后才能被微生物吸收利用。微生物的胞外酶（如淀粉酶、脂肪酶等）主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。将大分子物质分解的过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可以改变培养基的PH，使PH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。（2） 糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸和气体，有些细菌只产酸不产气。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（PH6.8）转变为黄色（PH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。（3）IMViC试验吲哚试验：用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。吲哚对二甲基氨基苯甲醛反应：甲基红试验：用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（PH6.3）转变为红色（PH4.2），即甲基红反应。12.酶活测定DNS法酶活力单位定义为:产果胶酶的菌株：规定每ml果胶酶液降解果胶底物每分钟产生1g还原糖为1个酶活单位。产几丁质酶的真菌：在选定反应条件下, 每分钟释放相当于1mol N-乙酰氨基葡萄糖( NAG)NAG 所需酶量为1 个酶活力单位(U)。甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。13.分类鉴定方法根据菌落形态（包括细菌的运动性），镜检形态（采用显微镜镜检法获取微生物基本信息。如形态、有无芽孢等特征、革兰氏染色结果等）等指标查伯杰氏手册，确定微生物基本范围，暂定菌属。三实验材料1. 土样7号土样2.菌种从土壤中分离得到的产果胶酶的细菌和产几丁质酶的霉菌。3.培养基几丁质酶筛选培养基 液体PDA培养基 固体PDA斜面培养基 几丁质酶发酵培养基果胶酶筛选培养基 液体种子、发酵产酶培养基固体斜面培养基 固体淀粉培养基固体油脂培养基 葡萄糖发酵培养基（附德汉式小管） 蛋白胨水培养基 乳糖发酵培养基（附德汉式小管） 葡萄糖蛋白胨水培养基 牛肉膏蛋白胨半固体培养基4.溶液和试剂酵母膏，KH2PO4，K2HPO4，FeSO4 ，MgSO4·H2O， ZnSO4，几丁质，马铃薯，蔗糖，琼脂，果胶， MgSO4，葡萄糖，酵母粉，蛋白胨，NaCl，可溶性淀粉，蒸馏水，香油或花生油，1.6%中性红水溶液，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，乳糖，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，乙醇，5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，甘油，甲基红指示剂，乙醚，吲哚试剂，无菌水，刚果红，DNS等。5.其他器材平板，试管，玻璃棒，三角瓶，量筒，移液管，移液器，烧杯，载玻片，盖玻片，滴管，漏斗，酒精灯，德汉氏小管，U 型玻棒，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），普通光学显微镜，血球计数板，计数器，接种环，接种针，电子天平，分析天平，试管架，称量纸，标签纸， 吸水纸，擦镜纸，滤纸，加热器，高压蒸汽灭菌锅，恒温箱，纱布，解剖刀，镊子，载玻片夹子，止水夹，记号笔等。四实验步骤（1）配制果胶酶筛选培养基250mL,几丁质筛选培养基200mL,0.85的生理盐水200mL。（2）取5支试管，每支装入9mL生理盐水，取一只300mL锥形瓶，装入90mL生理盐水，加入少许玻璃珠。将培养基和生理盐水包好、灭菌备用。（3）将10g土样（7号）溶解到装有90mL0.85的生理盐水的三角瓶中，摇床30min左右，然后放在30恒温培养箱中静置15min。用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3两种稀释度的土壤溶液（如下图）；产果胶酶细菌的筛选（1） 冷却果胶酶筛选培养基倒平板（6个）。（2） 选取10-1和10-3两个稀释度，每稀释度3个平板，每平板加液，刮刀涂布，30倒置培养 1-2天。产几丁质酶霉菌的筛选（1） 倒平板（6个）。（2） 选取100和10-2两个稀释度，每稀释度3个平板，每平板加液，刮刀涂布，30倒置培养3-4天。3.菌种的分离与纯化（斜面菌种保存）（液体种子）及菌种能力检测菌种的分离与纯化（1）培养后，如菌落周围有透明圈，将平板菌落用刚果红染色，具体方法为：用0.5%的刚果红染色1520分钟后，倒掉刚果红，用1M的NaCl脱色几分钟直至观察到透明圈。出现透明圈则说明此菌具有产果胶酶/几丁质酶的能力。（2）选取此菌进行菌落描述。（3）用接种环挑取较大透明圈的单菌落至筛选培养基平板，划线分离单菌落。划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域，然后将接种针在火焰上进行灭菌操作，取含菌种的培养皿，在火焰上方（注意：不能离火焰太近）打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。操作完毕后对接种针进行灭菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种针冷却后从1区引线到2区，再如图所示划线，划完后引线到3区，同上进行划线，划线完毕后盖盖平放；（4）培养后观察是否为纯菌，若菌落形态一致，则挑取单菌落至斜面培养基中培养至长好。若不纯则分别挑取形态不同的菌落分别在筛选平板划线，刚果红确定透明圈，重复挑取和纯化步骤直至得到纯菌落。（5）将菌种点种在选择培养基上，记录透明圈直径，以区分菌种的能力。（6）挑取菌种至固体斜面培养基中培养，将斜面置于4冰箱保存。菌种能力检测（1）分别配制果胶酶筛选培养基和几丁质酶筛选培养基，110 度灭菌 20-30 分钟，冷却后倒平板。几丁质酶筛选培养基加入配好的链霉素1ml/L培养基后再倒平板。（2）在培养皿盖周边用记号笔做好标记，将分离纯化的细菌霉菌分别点种于平板上（注意：点种的量不宜过多，以 34个为宜），在30培养箱中培养 12 天（霉菌23天），取培养后的果胶酶筛选培养平皿用 0.5的刚果红染色 15-20min 后，倒掉刚果红，用 1mol/L 的 NaCl 脱色几分钟至观察到透明圈，霉菌直接观察透明圈，测量并记录透明圈的大小。5. 细菌的革兰氏染色（1）制片 取片擦净，并烘干，取活跃生长期细菌按常规方法（酒精灯旁边接种细菌）涂片（不宜过厚）、干燥和固定。（2）初染 滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1.5min后倾去染液，水洗至流出水无色。（3） 媒染 先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗流出水无色。（4） 脱色 将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管覆盖95%乙醇脱色30s，然后立即用水洗去乙醇。（5） 复染 将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色1.5min，水洗，吸去残水晾干。（6） 镜检 油镜下观察细菌革兰氏染色结果。6. 细菌的芽孢染色（1）制片 取一洁净载玻片，在其上选取合适位置并分别滴上一滴无菌水；在无菌水中分别用接种环接种上少许所分离细菌的新鲜菌种；用载玻片夹子夹住载玻片在酒精灯上加热烘烤片刻，使菌液干燥并将菌种固定。（2）加热染色 向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸气并维持5 min，加热时注意补充染液（待玻片冷却后再补充染液），切勿让玻片干涸。（3）脱色 将玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。（4）复染 用0.5%番红水溶液复染2 min。（5）水洗 用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。（6）镜检 将载玻片晾干后用油镜镜检。7. 细菌运动性检测半固体穿刺法 (1)配制培养基 配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基，分装于3支试管内，110度灭菌20-30分钟，正立于烧杯中冷却至室温；(2)在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近(但勿触及)试管底,然后原路退出。如图所示： (3)接种完成后在30条件下培养两天观察并判断其运动性。（1）清洗玻片 选择光滑无裂痕的玻片，置洗含衣粉过的水中煮沸20min。取出用清水冲洗，沥干水后，置95%乙醇中浸泡，用时取出在火焰上烧去酒精。（2）菌液制备 菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上连续移接3-5代，以增强细菌的运动力。无菌操作，用接种环分别在枯草芽孢杆菌斜面培养基和铜绿假单胞菌斜面培养基上挑取菌落边缘菌体，接种环接触提前滴在载玻片上的水滴上，制成轻度混浊的菌液，注意不要剧烈震荡。（3） 涂片 将玻片缓缓倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。（4） 染色 滴加硝酸银染液A液覆盖菌面35min；用蒸馏水充分洗净A液；用硝酸银染液B液洗去残留水分后，再滴加B液覆盖菌面数秒至1min，其间可用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。（5） 镜检 先低倍镜观察，再高倍镜观察，最后用油镜观察。镜检时，如未见鞭毛，应在整个涂片上多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛。菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。 9.霉菌小室培养（1） 配制马铃薯培养基配制200ml马铃薯培养基（PDA），其成分配比及配制方法见附录。灭菌后无菌操作，取培养基分别倒少量于灭菌培养皿中，使之凝固成薄层。再将这一层培养基用解剖刀切割为若干1cm²左右的琼脂块。（2） 制作小室及接种培养 制作：在平皿底部铺一张略小于皿底的圆滤纸片，在其上放一U型玻棒。在玻棒上放上一块载玻片。取方形琼脂块，将其移至载玻片上，载玻片两端各放置一块。小室培养法，图： 接种：用接种环挑取很少量的菌落接种于琼脂块的边缘上，用无 菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。（同一块载玻片上的两块培养基上接种不同菌种） 培养：无菌操作，在培养小室中滤纸片上滴加23ml灭菌甘油,盖上皿盖,于27恒温箱中正置培养一周左右。（3）镜检观察从培养箱中取出载玻片在低倍镜下观察并记录四种霉菌菌丝体及孢子的形态特征，查图谱,定属,必要时可换高倍镜观察。10细菌的生理生化试验淀粉水解试验（1）配制固体淀粉培养基，高温蒸汽121灭菌20min，待培养基冷却至50左右，无菌操作制成平板（两个）；（2）用记号笔在平板底部划成四部分，并标明1、2、3；（3）无菌操作将所分离菌种分别在不同的区域点种，贴标签纸，注明每一区域对应接种的菌种号；（4）将平板倒置，在37温箱中培养12d；（5）观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。油脂水解试验（1）配制固体油脂培养基，高温蒸汽121灭菌20min，待培养基冷却至50左右，无菌操作制成平板（两个）；（2）用记号笔在在平板底部划成四部分，并标明1、2、3；（3）无菌操作将所分离菌种分别在不同区域划十字接种，贴标签纸，注明每一区域对应接种的细菌号； （4）将平板倒置，在37温箱中培养12d；（5）取出平板，观察菌苔颜色。如果出现红斑点，说明脂肪被水解，为阳性反应。糖发酵试验（1）用标签纸在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌号；（2）取葡萄糖发酵培养基试管4支，分别接1号菌种1支、2号菌种1支，2号菌种1支，第4支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基4支，分别接1号菌种1支、2号菌种1支，2号菌种1支，第4支不接种，作为对照；（3）将已接种的和作为对照的8支试管均置37中培养12d；（4）观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。吲哚试验（1）用标签纸在各试管外壁上分别标明培养基的名称和所接种的细菌号；(2)取4支蛋白胨水培养基试管，分别接1号菌种1支、2号菌种1支，2号菌种1支，第4支不接种，作为对照；（3）将已接种的和作为对照的4支试管均置37中培养12d；（4）向蛋白胨水培养基内加入34滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。配蛋白质水培养基，所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的，如用胰蛋白胨水解酪素得到的蛋白胨中色氨酸含量较高。甲基红试验（1）用标签纸在各试管外壁上分别标明培养基的名称和所接种的细菌号；(2)取4支葡萄糖蛋白胨水培养基试管分别接1号菌种1支、2号菌种1支，2号菌种1支，第4支不接种，作为对照； （3）将已接种的和作为对照的4支试管均置37中培养12d；（2）向葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。11.细菌及霉菌的液体酶活测定细菌液体酶活测定 (1)种子培养：选取透明圈最大的菌测定液体酶活。从长好的平板上挑取单菌落接种到液体种子试管培养基中，30摇床培养1d左右。(2)发酵培养：按接种量的5%将种子培养基接到发酵产酶培养基摇瓶中，摇瓶为300ml三角瓶，装液量为50ml，30培养，每隔12小时取样测酶活。(3)酶活的测定 采用DNS法，规定每ml果胶酶液降解果胶底物每分钟产生1 g还原糖为1个酶活单位。具体方法如下：绘制标准曲线：配置0.1 mol/L的葡萄糖溶液，然后将其稀释1倍、2倍、3倍和4倍。取2.0 ml稀释液加入3.0 ml DNS，煮沸5分钟，冷却后加水15 ml，再将其稀释5倍，540 nm下测定吸光度。（标准曲线已有）。样品吸光度测定：吸取0.2 mL适当的稀释酶液于试管中，加18 mL、的磷酸盐缓冲液配制的浓度为1的果胶底物溶液，50水浴反应30 min后，立即加入2 mL的DNS终止反应，沸水浴10 min，冷却后蒸馏水定容到12.5 mL，摇匀。对照：吸取0.2 mL稀释酶液于试管中，加2 mL的DNS和1.8 mL、的磷酸盐缓冲液配制的浓度为1的果胶底物溶液，50水浴反应30min，沸水浴10 min，冷却后蒸馏水定容到12.5 mL，摇匀。在540 nm下测定其吸光值。霉菌的液体酶活测定（1） 种子培养选取透明圈最大的菌测定液体酶活。从长好的平板上挑取单菌落接种到液体PDA培养基中，30摇床培养1d左右。（2） 发酵培养按接种量的5%将种子接到发酵培养基摇瓶中，摇瓶为300ml三角瓶，装液量30ml，30培养，（一瓶足够测定）。每隔12小时取样1ml测酶活。（3） 酶活的测定 采用DNS法，酶活力单位定义为: 在上述反应条件下, 每分钟释放相当于1mol N-乙酰氨基葡萄糖( NAG)NAG 所需酶量为1 个酶活力单位(U). 具体方法如下：样品吸光度测定： 吸取0.2 mL酶液于试管中，加1.8 mL、的磷酸盐缓冲液配制的浓度为的几丁质底物溶液，37水浴反应30 min后，立即加入2 mL的DNS终止反应，沸水浴10 min，冷却后蒸馏水定容到12.5 mL，摇匀。对照：吸取0.2 mL稀释酶液于试管中，加2 mL的DNS和1.8 mL、的磷酸盐缓冲液配制的浓度为的果胶底物溶液，37静置30min，沸水浴10 min，冷却后蒸馏水定容到12.5 mL，摇匀。在540 nm下测定其吸光值。标定时用蒸馏水做空白，若吸光度数值超过，需要稀释后测定结果。将测定结果减去对照则为酶活数据，吸光度越大，表示酶活越高，根据标准曲线将吸光度换算为酶活单位。12.查阅伯杰氏系统细菌学手册对所分离纯化的细菌定属。五实验报告1. 土壤中细菌菌落数量及特征菌落菌落特征数量大小颜色干湿边缘表面中央1小白色干燥整齐光滑凸起12小橙色湿润整齐光滑凸起63小深黄色湿润整齐光滑凸起34较小鹅黄湿润整齐光滑微凸起15较小浅灰橙湿润整齐光滑不凸起16较小白色干燥整齐光滑不凸起27中等白色干燥整齐光滑不凸起38中等前灰白湿润整齐光滑微凸起39中等浅灰白边缘干燥，中央湿润褶皱较光滑微凹陷410极小白色湿润整齐光滑微凸起511较小浅灰黄干燥整齐光滑微凸起2菌种1中等浅黄色湿润整齐光滑凹陷2菌种2中等黄色湿润整齐光滑凹陷1菌种3中等白色湿润整齐光滑凹陷12.简单染色菌种1 菌种2 菌种3菌种菌种1菌种2菌种3菌体形状球形杆状球状3.细菌的革兰氏染色菌种1 菌种2 菌种3菌种菌种1菌种2菌种3革兰氏染色结果G+性G+性G+性4.细菌的芽孢染色菌种1 菌种2 菌种3菌种菌种1菌种2菌种3是否具有芽孢有有有5.细菌运动性检测半固体穿刺法菌种菌种1菌种2菌种3运动性观察结果无运动性无运动性无运动性6.霉菌小室培养霉菌1 霉菌2霉菌3 霉菌4菌种菌落特征菌种1未记录菌种2菌丝无隔，分支状，部分菌丝上直接生出菌丝梗，顶端膨大成球形菌种3菌丝有隔，无假根，顶端不形成膨大的球形包囊，成扫帚状菌种4菌丝有隔；孢子丝，多次分支形成几轮对称或不对称的小梗，小梗顶端有孢子，孢子梗顶端不膨大（无孢囊）；无假根7.淀粉水解试验菌种能否水解淀粉水解圈直径/cm菌种1能菌种2能菌种3能0.58.油脂水解试验菌种能否水解油脂菌种1能菌种2能菌种3不能9.糖发酵试验1号 葡萄糖 乳糖菌种葡萄糖乳糖菌种1+-菌种2-菌种3-空白对照-10.IMViC试验 1号吲哚试验 甲基红试验菌种吲哚试验甲基红试验菌种1+-菌种2-菌种3-对照-11.液体酶活测定细菌（菌种1）第1次实验组对照组酶活第2次实验组对照组酶活第3次实验组对照组0.075酶活第4次实验组对照组0.275酶活第5次实验组对照组酶活第6次实验组对照组酶活-12.酶活曲线细菌酶活曲线标准曲线13.细菌定属细菌1 根据伯杰氏手册，由于细菌普通染色观察为球形或杆形，革兰氏染色为G+性，有芽孢，半固体穿刺为无运动性，无鞭毛，生理生化试验中可以分解淀粉，可以分解油脂，可以分解葡萄糖，不可以分解乳糖，甲基红实验变黄，吲哚实验产生玫瑰吲哚环，菌落特征为中等大小，浅黄色，湿润，边缘整齐，中央略凹陷，表面光滑，判断细菌为葡萄球菌。细菌2 根据伯杰氏手册，由于细菌普通染色观察为杆形，革兰氏染色为G+性，有芽孢，半固体穿刺为无运动性，无鞭毛，生理生化试验中可以分解淀粉，可以分解油脂， 葡萄糖发酵不产酸不产气，不可以分解乳糖，甲基红实验变黄，吲哚实验不产生玫瑰吲哚环，菌落特征为中等大小，黄色，湿润，边缘整齐，中央略凹陷，表面光滑，判断细菌为芽孢杆菌属。细菌3根据伯杰氏手册，由于细菌普通染色观察为球形，革兰氏染色为G+性，有芽孢，半固体穿刺为无运动性，无鞭毛，生理生化试验中可以分解淀粉，可以分解油脂， 葡萄糖发酵不产酸不产气，不可以分解乳糖，甲基红实验变黄，吲哚实验不产生玫瑰吲哚环，菌落特征为中等大小，白色，湿润，边缘整齐，中央略凹陷，表面光滑，判断细菌为链球菌属。14.霉菌定属霉菌2菌丝无隔，分支状，部分菌丝上直接生出菌丝梗，顶端膨大成球形，根据以上特征判断，该霉菌属于毛霉属。霉菌3菌丝有隔，无假根，顶端不形成膨大的球形包囊，成扫帚状，根据以上特征判断，该霉菌属于青霉菌属。霉菌4菌丝无隔，形成匍匐菌丝，有假根，菌丝顶端膨大成球形包囊，根据以上特征判断，该霉菌属于根霉属。六 实验心得（1）通过实验我们学习了微生物实验中基本的操作技能，掌握了配置培养基的一般方 法和步骤、从土壤中分离微生物的方法，对无菌操作技术有了一定的了解，同时使组员 的合作更加高效、密切。 （2）在做关于分离实验时，无菌操作特别重要。因操作不当很容易感染，使所做的平板 或斜面失败，故操作前应先对所要使用的物品进行紫外线灭菌， （包括操作前要给自己的手用75%的酒精消毒） ；操作时应严格遵守操作规程，勿将实验操作在无菌工作台外进行，避免因人为因素而使实验产生误差。 （3）掌握足够的理论知识是我们能够较好的理解和完成实验的一个先决条件。因此，我 们要学习好相关的理论知识，做好实验前的预习工作。 （4）根据不同的微生物生长对不同环境适应能力不同，实验中我们加入一些特定的物质 （如链霉素等） ，抑制那些不适应该环境的的菌种的生长从而筛选出我们所需的菌种。 （5）微生物与我们生活息息相关，在食品行业中至关重要，作为食品专业的学生应认真 学习这门学科，并掌握其实验操作。七附表：试验中所需培养基配方几丁质酶筛选培养基几丁质2g酵母膏3gKH2PO40.3gK2HPO4gFeSO4gMgSO4·H2OgZnSO4gpH110灭菌20min。灭菌后降温至不烫手加入配好的链霉素1ml/L培养基。几丁质酶发酵培养基几丁质5g酵母膏3gKH2PO4K2HPO4FeSO4MgSO4·H2OZnSO4pH110灭菌20min。液体PDA培养基 马铃薯200g蔗糖20gpH?110灭菌20min。固体PDA斜面培养基马铃薯200g蔗糖20g琼脂18gpH?110灭菌20min。果胶酶筛选培养基果胶2g酵母膏2gK2HPO41gMgSO4FeSO4琼脂20gpH110灭菌20min。液体种子、发酵产酶培养基果胶5gK2HPO41gMgSO4酵母膏2gFeSO4琼脂20gpH110灭菌20min。固体斜面培养基葡萄糖10 g酵母粉5 g蛋白胨5 gNaCl5 g琼脂20 g110灭菌20min。淀粉培养基蛋白胨10gNaCI5g牛肉膏5g可溶性淀粉2g蒸馏水1000ml琼脂1520g121灭菌20min。油脂培养基蛋白胨10g牛肉膏5gNaCI5g香油或花生油10g1.6%中性红水溶液1ml琼脂1520g蒸馏水1000mlPH121灭菌20min。蛋白胨水培养基蛋白胨10gNaCI5g蒸馏水1000mlPH121灭菌20min。糖发酵培养基蛋白胨水培养基1000ml1.6%溴甲酚紫乙醇溶液12mlPH另配20%糖溶液（葡萄糖、乳糖）各10ml121灭菌20min。葡萄糖蛋白胨水培养基蛋白胨5g葡萄糖5gK2HPO42g蒸馏水1000mlPH121灭菌20min。