中药有效成分及其类似物对乙酰胆碱酯酶.doc

中药有效成分及其类似物对乙酰胆碱酯酶抑制作用研究鲍雅丹 马 林*基金项目：中山大学化学与化工学院第三届创新化学实验基金项目（批准号：02002）资助第一作者：鲍雅丹（1980年出生），女，中山大学化学与化工学院材料化学专业99级指导教师：马林 Email：cesmal中山大学化学和化工学院有机化学研究所，广州 51027摘要 本研究对从中药提取有效成分及合成一系列类似物进行了抑制乙酰胆碱酯酶活性测试.发现具有苯环或共轭结构化合物对乙酰胆碱酯酶有显著抑制作用，特别是吲哚喹啉化合物19c抑制效果最好(IC50=4.8M)，可以作为治疗阿尔茨海默氏病先导药物。关键词 乙酰胆碱酯酶 抑制剂 IC50 动力学阿尔茨海默氏病(Alzheimers disease, AD)是常见一种中枢神经系统退行性病变，发病率较高。主要临床表现为记忆、智力和识别功能不同程度减退或丧失,目前临床上用于改善AD患者认知障碍药物主要是乙酰胆碱酯酶抑制剂。在大规模、多中心、双盲和安慰剂对照试验中,这类化合物对AD病人认知能力及生活质量均有统计学显著改善。美国Warner lamber 公司开发他克林(tacrine)1是一种乙酰胆碱酯酶非竞争性抑制剂,1993年经FDA批准上市, 成为第一个用于治疗ADACh E剂类药物。此后又有数种ACh E抑制剂经FDA批准上市或进入临床试验, 如Velnactine、Amiridine等。但它们均有不同程度毒副作用, 这些毒副作用严重影响了它们在临床上应用, 这使得有必要开发疗效高毒副作用更小ACh E抑制剂。乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, ACh E, EC3 . 1 . 1 . 7. )主要生理功能为通过快速水解神经传递介质乙酰胆碱（ACh），中止胆碱能突触中脉冲传递，故 ACh E又称乙酰胆碱水解酶 (acetylcholine hydrolase)2。CH3COOCH2CH2N+(CH3)3+ACh E CH3CO-ACh E + HOCH2CH2N+ (CH3)3 CH3COO-+H+ACh E 为了筛选出高效、低毒ACh E抑制剂，我们参考各种ACh E抑制剂结构类型，研究了从中药山芝麻和筋骨草分离出有效成分及其类似物对ACh E抑制作用。1 实验部分1.1 材料和仪器乙酰胆碱酯酶 (Acetylcholinesterase,ACh E, EC3 .1.1.7.)、硫代乙酰胆碱 (Acetylthiocholine)、5, 5 -二硫代双 (2 -硝基苯甲酸 ) (DTNB)购于Sigma公司；其它试剂为分析纯试剂，未经进一步纯化。主要测试仪器：UV-2501PC 型紫外光谱仪、Orion Model 720A型pH计、Gunt w28 恒温水浴锅。1.2方法1.2.1 抑制剂制备：全合成化合物19 (a-j) 由本实验室周金林博士提供；化合物1-18由郭新东博士提供从中药山芝麻和筋骨草中分离有效成分，结构如下：1 2 3 4 5 67 8 910 11 12 13 14 15 16 17 181.2.2 化合物对乙酰胆碱酯酶抑制活性测定取5支1.5 mL分别装有840 m L 0.1 M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液梨型管，依次加入0，5，10，20，35，50 m L 1.0 mM样品DMSO溶液，并用DMSO补齐至总体积为890 m L。分别加入50m L 4 mg/mL 5, 5-二硫代双 (2 -硝基苯甲酸 )和10 mL乙酰胆碱酯酶溶液（0.1mg/ml），并在37保温15 min。立即加入50L2 mg/mL硫代乙酰胆碱溶液，摇匀后测其在= 412 nm处A值(An)。参比用0.1 M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液。以未加样品所测得Acontrol值作为100个活力单位：相对酶活力(An /Acontrol)×100然后以酶相对活力对抑制剂浓度作图，根据抑制曲线求得各种化合物IC50值（抑制酶活力50时抑制剂浓度）。1.2.3 乙酰胆碱酯酶抑制动力学测定取5支1.5 mL分别装有840，855，865，880，885 mL 0.1 M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液梨型管，加入一定量样品溶液，并用DMSO补齐至总体积5。分别加入50 mL 4 mg/mL 5, 5 -二硫代双 (2 -硝基苯甲酸 )和10 mL乙酰胆碱酯酶溶液，并在37保温15 min。立即分别加入50，35，25，10，5 mL2 mg/mL硫代乙酰胆碱溶液，摇匀后测其在=412 nm处时间扫描曲线。曲线斜率即为反应初速度V，然后以1/V对1/S作图，以不加抑制剂为控制线。2 结果和讨论2.1 吲哚喹啉生物碱衍生物对ACh E抑制活性表1 吲哚喹啉衍生物对ACh E抑制IC50值CompoundXnRIC50(mM)pH=7pH=819aNH2N(CH3)2384219bO2N(CH3)27389.519cNH3N(CH3)24.841.519dO3N(CH3)2576819eNH223.72919fO2202219gNH2OH213019hO2OH5376.5CompoundXnRIC50(mM)pH=7pH=819iNH-4623519jO-58163从他克林等化合物结构可以看出，它是一种喹啉衍生物，具有三环结构，而我们所合成吲哚喹啉衍生物在结构上和他可林有许多相似之处，为此我们研究了它们对乙酰胆碱酯酶抑制活性，结果见表1。实验结果表明，吲哚喹啉类衍生物（19a-19j）对乙酰胆碱酯酶均有明显抑制作用，化合物19c抑制效果最好(IC50=4.8 mM) 。五元环上X原子为NH抑制效果比O好，原因是NH可增加环共轭性，使四个环在一个平面上；而O使环面不在同一个平面上，增加了空间位阻，对酶抑制作用降低。化合物19c比19a侧链上多了一个碳原子，抑制酶效果增强，说明碳链长短对抑制活性起作用。另外，抑制剂侧链上有亲脂性阳离子头能更好被酶作用位点吸附而较好地抑制酶活性，化合物19b，19e抑制活性都没有19c好可能是由于19b羟基不易以正离子形式存在，而19e苯酚不是脂肪族侧链，且位阻较大，也没有阳离子头，较难产生抑制作用。此外，该系列化合物pKa值都在8左右。pH7时化合物以盐形式存在，环上N带正电荷；pH=8时化合物没有成盐，不能很好抑制酶活性。可以看到上表中所有化合物都在pH7酸碱体系中有更好抑制效果。 由以上讨论，我们可得出以下几个影响抑制剂抑制活性因素：（1）分子中心存在一个吲哚喹啉共轭环；（2）侧链上存在一个亲脂性阳离子头；（3）脂肪族侧链大于两个C原子；（4）合适体系pH值。2.2 中药有效成分（化合物1-18）对ACh E活性抑制由表2可以看出，五环三萜类化合物4、5、6和7具有较好活性，和这些化合物大分子结构有关，其中化合物5抑制活性最好(IC50=13.2 mM)，可能由于它大分子结构容易和酶活性部位结合。其次是化合物10整个分子形成了大共轭结构，具有很好活性(IC50=23.8 mM)。合成醌类化合物和中间体对ACh E抑制活性都比较差，或者是没有活性，或者是由于化合物分子太小，不能和乙酰胆碱酯酶发生结合，因而不能有效抑制酶活性；而同样是萘醌结构化合物具有较好活性，可能是化合物12中含一个二氢呋喃环，使分子形成三环平面结构，扩大了分子面积能和乙酰胆碱酯酶内多个位点作用，而有较好活性；甾醇8和甾醇糖甙9没有共轭结构，对ACh E没有抑制作用。表2 中药有效成分对ACh E抑制IC50值CompoundIC50(mM)CompoundIC50(mM)1169.6777.82160.48No3No9No463.513170.8513.217162.7655.614140.81228.315No1023.816No1149.618No No表示没活性2.3 乙酰胆碱酯酶抑制动力学研究为了研究这些化合物对乙酰胆碱酯酶抑制动力学行为，我们选取了化合物19c、19f、19g、19i、5、10、17和13进行实验。根据不同浓度抑制剂和底物存在下所测得数据绘制Lineweaver-Burk曲线见图1。图1 化合物和乙酰胆碱酯酶反应Lineweaver-Burk图数据表明化合物19g、19i、10对乙酰胆碱酯酶抑制为混和型抑制剂；化合物19c、19f、13、17为非竞争性抑制剂，和酶调控部位结合；大分子化合物5为竞争性抑制剂进入酶活性中心发生抑制作用。以上结果表明化合物19c抑制效果最好（IC50=4.8mM），可以作为先导化合物；而化合物5（IC50=13.2mM）和目前临床用抑制剂他克林（IC50=13.0mM）具有类似抑制效果；由于齐敦果酸型五环三萜类化合物具有消炎、增强免疫、抑制血小板降集、降糖以及治疗急性黄胆型肝炎和慢性病毒肝炎作用12，我们可以将它作为具有多种功能药物来开发。其次是具有苯环和共轭萘醌类化合物12（IC50=28.3mM）和10（IC50=23.8mM）及吲哚喹啉衍生物，它们也有较好抑制活性，可以将它们作为先导化合物，在分子中引入带正电荷基团如氨/胺基，增强分子和ACh E作用，提高它们抑制效果。致谢 本研究是在马林教授，郭新东和周金林两位博士悉心指导和帮助下完成，他们对科学严谨态度和孜孜不倦精神使我受益菲浅，在此对他们表示衷心感谢。同时还要感谢化工学院创新基金对本研究提供资助。参 考 文 献1 Bartus B T, Dean R l, Pontecorvo M J, et al. 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The presence of aromatic ring and conjugate structure was found to have good cholinesterase inhibitory activity when tested for the inhibition of electric eel acetylcholinesteras. Among them , compound 19c showed the most potent inhibitory activity (IC50=4.8M).Keywords acetylcholinesterase , inhibitor , IC50 , dynamics