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绪论 基础免疫学理论相关内容：抗原、抗体、补体、细胞因子、HLA、免疫系统、免疫应答 临床免疫学抗感染免疫、超敏反应、自身免疫、肿瘤免疫、移植免疫 免疫学实验技术免疫学检验抗原抗体反应 抗原抗体反应：高度特异性 体内：体液免疫效应体外：血清学反应 (沉淀反应、凝集反应、补体参及的溶血反应、补体结合试验、中和试验、免疫标记技术) 原理内因：Ag、Ab能特异性结合外因：Ag、Ab结合的动力 静电引力（库仑引力） 范德华力（电子云力） 小于静电引力 氢键 大于范德华力 疏水作用力（作用最大） 盐析：在高浓度电解质（如NaCl）存在的条件下，NaCl可先及Ab分子结合（在Ab未及Ag相遇时），排斥H2O分子，从而使Ab蛋白质优先沉降 特点：1. 特异性：交叉反应（cross-reaction）：抗体对具有相同或相似抗原表位的不同抗原的反应。先决条件：存在共同Ag表位意义：免疫学诊断：外斐氏反应用变形杆菌OX19、OX2、OXk做抗原查血清抗体，诊断斑疹伤寒（立克次氏体感染所致） 免疫病理损害（Eg：链球菌感染后易导致肾小球肾炎，原因是链球菌及人体肾小球基底膜有共同Ag表位所致）2. 最适比例Ab过剩，前带 （可溶性抗原抗体复合物）Ag过剩，后带 （可溶性抗原抗体复合物）Ab、Ag合适比例 沉淀物 等价带 （沉淀物） 抗体（等价带范围不同） R型抗体 家兔免疫血清 较宽 大多数小动物 H型抗体 马免疫血清 较窄 人和多数大动物3. 可逆性：Ag+AbAgAb原因：非共价键结合，不是化学反应 影响因素自身因素：Ag：理化性质、抗原表位数目及种类 Ab：来源（R型or H型）、特异性、亲和性、浓度外界环境条件：电解质：0.9%NaCl，if浓度过高，会盐析 pH：68，if小于3，酸凝集；过高，碱变性 温度：37沉淀反应及免疫电泳 颗粒型抗原 凝集反应 eg：细菌、RBC 可溶性抗原 沉淀反应 eg：血清蛋白溶液、多糖抗原 沉淀反应（precipitation reaction）：可溶性抗原及相应抗体结合，在电解质存在，两者比例恰当时，可出现肉眼可见的沉淀现象 Ag：沉淀原 Ab沉淀素 实验中为使抗原抗体比例（数量）恰当，应稀释Ag 分类 液相沉淀：絮状沉淀、环状沉淀、免疫比浊测定 凝胶扩散：双扩、单扩 凝胶免疫电泳：免疫电泳、对流免疫、火箭免疫 絮状沉淀试验出现絮状/块状沉淀玻片法：检测病毒（定性）试管法：方阵滴定（半定量） 环状沉淀反应测抗原（法医血迹鉴定） 免疫透射浊度测定法检测IgG、IgA、IgM、C3 凝胶扩散（agar immunodiffusion）：可溶性抗原及相应抗体在电解质存在下，在琼脂基质中扩散，当两者相遇，比例恰当时结合，可出现肉眼可见的沉淀线 双扩（double immunodiffusion）原理：可溶性抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自向四周凝胶中扩散，当二者相对应时即发生特异性反应，在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线方法： 制琼脂板（3ml 1.5%NS琼脂） 打孔（双孔型/三角孔型/梅花孔型） 加样（平孔沿加满） 扩散（37，24h观察结果）用途： 双孔型：已知Ag测未知Ab，or已知Ab测未知Ag 三角孔型：抗原性质分析 梅花孔型：测Ag有效稀释度优点：简单、易行、用途广缺点：敏感性低、出结果慢、只定性，不能定量 单扩（single immunodiffusion）原理：将一定量抗体混浇于琼脂内，置于凝胶孔中的定量抗原向四周扩散，抗原及相应抗体在比例合适处形成白色沉淀环，其大小及抗原浓度成正比方法： 已知抗体+琼脂制板，打孔 在琼脂板小孔中加梯度抗原 抗原向四周扩散形成沉淀环 抗原浓度及沉淀环直径呈线性关系，绘制标准曲线 从标准曲线上查出并计算出待测标本含量用途：定量测定IgG、IgA、IgM、C3等含量 影响电泳的因素溶液的pH，常用89，蛋白质带负电溶液的离子强度，越高，泳动慢，一般0.020.2M电场强度，越高，越快，一般46V/cm（琼脂长），约40V左右电渗作用：电场中液体对于一固体的固定相对移动的现象，电渗方向及电泳方向相反 对流免疫电泳（counter-immunoelectrophoresis）原理：定向加速的免疫双扩（双扩+电场，使抗原、抗体相对泳动）方法：Ag、Ab分别在琼制板上不同孔内，Ag在负极，Ab在正极，电泳 电压：46V/cm（琼脂长度） 时间：45分钟1小时 pH：8.6用途：检测HBsAg、AFP优点：耗时短、反应敏感性强 免疫电泳（immunoelectrophoresis）原理：Ag区带电泳+双扩结合方法：Ag电泳分出区带 Ag、Ab免疫双扩用途：分析复杂Ag的组分（人全血清组分的分析）、多发性骨髓瘤等疾病的测定优点：用样品量小，特异性高、分辨力强凝集反应 凝集反应（Agglutination）细菌、细胞等颗粒性抗原悬液加入相应抗体，在电解质存在下，两者特异性结合，出现肉眼可见得凝聚块Ag：凝集原 Ab：凝集素凝集反应应稀释抗体 沉淀试验和凝集试验的比较抗原性质 可溶性Ag 颗粒性Ag稀释对象 抗原 抗体结果现象 沉淀现象 凝集现象敏感性 低 高 分类： 直接凝集反应 玻片法 试管法间接凝集反应 （正向）间接（血、胶乳）凝集试验 反向间接（血、胶乳）凝集试验 间接凝集抑制试验 协同凝集试验 直接凝集反应（direct agglutination）细菌、螺旋体、细胞等颗粒性抗原（抗原时细胞表面结构）在适当电解质参及下，直接及相应抗体结合，出现肉眼可见的凝集现象 玻片法及试管法的区别 玻片法 试管法原理 已知抗体测未知抗原 已知抗原测未知抗体的效价 定性 半定量用途 ABO血型鉴定 肥达氏反应 菌种鉴定 外斐氏反应 间接凝集反应（indirect agglutination or passive agglutination）将可溶性抗原或抗体吸附在某种载体微球上，使之成为颗粒性抗原或抗体，然后再及相应的抗体或抗原结合，出现载体微球的凝集现象载体的要求：不干预免疫反应、颗粒大小均匀常用载体种类：红细胞（绵羊、家兔、人O型）聚苯乙烯胶乳颗粒（人工合成高分子材料）等活性炭粒、硅酸铝颗粒 致敏微粒/致敏颗粒：吸附有抗原或抗体的载体颗粒间接凝集试验命名（根据载体不同）血凝试验（以RBC为载体）乳胶凝集试验（以胶乳颗粒为载体） （正向）间接（血、胶乳）凝集试验原理：将已知的可溶性抗原吸附于颗粒性载体上，检测未知抗体 反向间接（血、胶乳）凝集试验原理：将已知抗体吸附于颗粒性载体上，检测未知抗原实例：检测HBsAg、AFP等 间接凝集抑制试验原理：待测样本（可溶性Ag？）+已知Ab +已知致敏Ag颗粒（已成为颗粒性Ag） 观察是否有凝集现象（不凝集为阳性，凝集为阴性）实例：检测小便中绒毛膜促性腺激素（HCG） 协同凝集试验（coagglutination）原理：实质为反向间接凝集反应实例：葡萄球菌A蛋白（SPA）能非特异性地及IgG的Fc段结合，当及特异性抗原相遇时，IgG的Fab段及抗原结合，出现金葡菌的凝集现象（属特殊间接凝集试验）用途：用已知抗体检测未知抗原，用于多种抗原的检测免疫标记技术 免疫标记技术的原理用可以微量检测的标记物（示踪物质）标记抗原或抗体，作为试剂，及相应抗体或抗原结合反应后，测定抗原抗体复合物中的标记物，从而推断所测抗体或抗原有无及量的多少免疫标记技术=免疫技术+标记技术免疫技术：抗原抗体反应（特异性）示踪物标记：酶、荧光素、同位素（灵敏性）特点：高特异性、高灵敏性 分类免疫标记技术 放射免疫技术 酶免疫组化技术 双抗体夹心法 免疫酶技术 竞争抑制法 免疫荧光技术 酶联免疫吸附技术 双抗原夹心法 其他标记技术 间接法 双位点一点法 常用标记物荧光素、酶、同位素、胶体金、可发光化学物质 免疫荧光技术（IF） 免疫荧光显微技术（定性） 免疫荧光测定技术（定量）原理：用荧光素标记抗原或抗体，及待测标本中相应抗体或抗原结合，通过检测荧光，确定标本中有无待测的抗体或抗原 常用荧光素异硫氰酸荧光黄（FITC） 黄绿色四乙基罗丹明（RB200） 橘红色四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） 橙红色 荧光显微镜主要组成A. 白炽光源（超高压汞灯） 紫外光or兰紫光B. 两组滤光板 激发滤板 激发光谱 抑制滤板 抑制紫外光or兰紫光，只许荧光通过C. 显微镜 普通光学显微镜光路程序：白炽光源发射紫外光or兰紫光激发滤板紫外光被检物（荧光染色标本）紫外光+荧光抑制滤板荧光（我们肉眼见） 一般免疫荧光显微技术均标记抗体 片子制作：切片、涂片、印片 荧光抗体染色法直接法：待测标本固定（Ag？）+*Ab*AgAb 用途：检测抗原 优点：快，直接，干扰因素少 缺点：每检测一种抗原要标记一种荧光抗体，较麻烦间接法（用得最多）Step1：荧光素标记抗抗体（如荧光素标记的羊抗人IgG）Step2：已知Ag固定+待测标本（Ab？）洗，+荧光标记的抗抗体洗，荧光显微镜镜检优点：制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种Ab检测 灵敏度高补体法Step1：荧光素标记抗补体Step2：已知Ag固定+待测标本（Ab？）+补体洗，+荧光标记的抗补体洗，荧光显微镜镜检优点：灵敏度高，制备一种荧光抗补体用于多种检测缺点：干扰因素多，补体不稳定，易失活，该法少用双标记法用两种荧光素（FITC、罗丹明）分别标记针对同一Ag上不同抗原表位的抗体，对同一标本染色，当Ag有两种相应抗原表位存在时，可同时见到黄绿和橙红两种荧光 免疫荧光显微技术优缺点优点：特异性、敏感性高 快速 可定位 既可测Ag又可测Ab缺点：需要荧光显微镜 存在非特异荧光干扰（原因是自发抗体不纯，交叉反应、技术问题） 定性测定、判断结果不客观 制备片子难保存（荧光猝灭） 时间分辨荧光免疫测定（液相检测）原理：用铕（Eu）等具有较长荧光寿命的稀土金属作荧光标记物来标记Ab或Ag，从而检测标本中相应Ag或Ab的新技术特点：利用时间分辨荧光仪延缓检测时间，排除非特异性干扰荧光 灵敏度可达0.21ng/ml免疫酶技术 优点：较IF、RIA更优越，敏感、安全、稳定、易观察结果 原理：利用酶标记Ag或Ab后不改变Ag、Ab反应特异性，同时又不影响酶的活性，结合在AgAb上的酶催化底物，生成有色产物，根据产物颜色深浅推测出待测物中相应物质（Ag、Ab）有无及含量多少Ag+AbEAgAbE+底物 呈色反应 特点特异性：Ag、Ab反应敏感性：酶的高效催化作用 分类酶免疫组织化学染色技术（免疫组化）酶免疫测定法（酶联免疫吸附试验，ELISA） 常用的酶辣根过氧化物酶HRP：铁卟啉蛋白质，能进入细胞内，酶活性强，酶结合物可长期保存，最适Ph为5.5左右碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶 纯度：RZ：反映酶含量及蛋白含量之比（最好RZ为3.0左右） 活性：每1mg酶中所具有的活性单位，应大于250u/mg 底物系统：供氢体、受氢体 HRP的底物邻苯二胺（OPD）反应体系中作为供氢体：DH2+H2O2D+2H2O 供氢体 受氢体 有色产物特点：有色产物为黄色，空白对照接近无色，敏感度高，有致癌作用四甲基联苯胺（TMB）特点：有色产物为蓝色，无致癌作用酶联免疫吸附试验（ELISA） 原理将酶分子及Ab或Ag连接成一酶结合物（酶标记物），当它及固相载体中相应Ag或Ab相遇，形成酶标记的AgAb复合物，加入底物，酶催化底物，生成有色产物，根据颜色深浅可测出溶液中Ag或Ab的量 有关术语及试剂包被（coat）：将Ag或Ab吸附在固相载体上的过程，又称固相化或吸附 包被后不能被洗脱 包被缓冲液：pH：9.6CB（碳酸盐缓冲液）洗涤（wash）：pH：7.27.4PBS（磷酸盐缓冲液）酶结合物：酶标抗体或酶标抗原终止液：2M H2SO4OPD（邻苯二胺）：酶催化后有色产物为黄色，H2SO4终止后橙色（棕色）TMB（四甲基联苯胺）：酶催化后有色产物为蓝色，H2SO4终止后黄色双抗夹心法 步骤包被已知Ab洗涤加待测标本（测Ag？）洗涤加酶标Ab洗涤加底物加终止液观察结果 用途检测抗原，包被的抗体及酶标抗体属同一种类抗体，每检测一种抗原就需制备相应的酶标抗体，较麻烦间接法测抗体 步骤包被已知Ag+待测标本（测Ab？）反应一段时间后，洗涤加酶标抗抗体（酶标羊抗人IgG）洗涤加底物加终止液，观察结果 用途测抗体，每标记一种抗抗体可以用于多种抗体的检测双位点一步法 步骤包被抗体A+待测标本+酶标抗体B洗涤，+底物终止液，观察结果 用途检测Ag，Ag至少含A、B两个抗原表位竞争法 步骤待测管：已知Ab包被+待测标本（Ag？）洗涤，+酶标Ag洗涤，+底物显色应用亲和素和生物素的ELISA亲和素（avidin）糖蛋白，一分子由四个亚基组成，每一亚基可以及一分子生物素结合生物素（biotin）维生素H，可及蛋白质、糖类、酶类等结合，及亲和素特异结合后极稳定生物素 生物素 亲和素生物素 生物素 ELISA结果的判定肉眼判定：及阳性、阴性对照颜色比较 若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性 若待检孔显色深于或等于阳性对照则判定为阳性 若待检孔显色介于阴性及阳性对照之间则判定为弱阳性酶标光度仪检测A492值（吸光率）：比色法 及阳性、阴性对照测定值比较 P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0为阴性 P：positive（待测吸光度值） N：negative ELISA试验的影响因素（一）固相载体常用：聚苯乙烯特点：吸附Ag或Ab的能力强，一旦吸附后，不能被洗脱 形状多试管、珠、微孔板（酶标板）、分软、硬板（最常用） 一次性使用，不可回收酶标板要求：吸附性能好、空白值低、透明度高、板批间、孔间性能相近（二）抗原、抗体Ag：需纯化Ab：需效价高、亲和力强、纯化（三）试验条件1. 包被：一般用pH9.6CB，0.05M，有利于蛋白质吸附 浓度：0.1100ug/ml，常用10ug/ml 时间、温度：4过夜或37，13h 量：100ul 封闭：用0.15%牛血清白蛋白缓冲液浸泡0.5小时2. Ag-Ab反应的条件微碱性有利于Ag-Ab结合，故用pH7.4PBS洗涤去污剂有利于Ag-Ab形成，洗液中加0.05%Tween-20Ag、Ab反应时间、温度：37、40min3. 洗涤采用pH7.27.4PBS洗涤，规一化，每次浸泡12min，拍干，共洗涤34次4. 酶促反应条件温度：37时间：10minpH：5.5底物量：一致5. 排除干扰：多设对照 ElISA应设哪些对照，why？阳性对照：排除假阴性；阴性对照：排除假阳性；酶结合物对照：加酶步加入，无色；底物对照：步加入，无色；空白对照：只加终止液，无色 膜载体的酶免疫测定斑点-ELISA：特点，固相载体为硝酸纤维素膜，酶促反应后在膜上形成有色沉淀物免疫印迹法（IBT） 应用（所有标记技术）病原体的诊断及研究病毒、细菌等传染病的诊断（测抗原或抗体）病毒、细菌表面抗原的研究某些疾病的诊断某些微量物质有关疾病的诊断肿瘤的诊断及定位自身抗体检测协助自身免疫病诊断寄生虫疾病的诊断等免疫学方面的研究T、B细胞的发生、演化、表面抗原改变等的研究微量物质的检测体内：微量蛋白质、激素、酶等抗原；药物、糖等半抗原工农业：微生物、微量物质等化学发光免疫分析技术 发光免疫技术是将发光系统及免疫反应相结合，来检测抗原、或抗体的方法 化学发光免疫测定化学发光酶免疫测定（CLEIA）试验前部分及ELISA一样，改变所加底物，使产物能发光，用仪器检测发光强度，判断结果（如酶是用辣根过氧化物酶，常用底物是鲁米诺或其衍生物）化学发光标记免疫测定（CLIA）是用化学发光剂作为标记物直接标记抗原或抗体的免疫测定方法金免疫技术 采用胶体金作为标记物 胶体金：又称金溶胶，是金盐（氯金酸）被还原（还原剂：柠檬酸钠）成原子金后的金颗粒悬液 胶体金的特性胶体性质：颗粒稳定均匀，分散悬浮，1100nm呈色性：颜色及颗粒大小有关25nm，橙黄色；1020nm，酒红色；3080nm，紫红色斑点金免疫渗滤试验（DIGFA） 原理采用胶体金标记抗体，以硝酸纤维素膜为载体，使抗原抗体反应和洗涤在同一渗滤膜上，反应后根据在膜上的颜色判断结果斑点免疫层析试验（DICA） 原理以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细管作用，使膜一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析 用金标记免疫法（斑点免疫层析试验）测HCG的原理对于HCG阳性标本，尿中HCG及金标记的鼠抗人HCG单抗结合形成免疫复合物，随层析作用向上移动，至检测线及鼠抗人HCG抗体结合而聚集显色，在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗（IgG）随着尿液上行，到达质控线及羊抗鼠IgG（二抗）结合而显色，作为质控对照；对于HCG阴性标本，尿中无HCG及金标记的鼠抗人HCG单抗结合形成免疫复合物，随层析作用向上移动，至检测线及鼠抗人HCG抗体不结合而不显色，在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗（IgG）随着尿液上行，到达质控线及羊抗鼠IgG（二抗）结合而显色，作为质控对照；若试纸条无效，金标鼠抗人IgG单抗随层析作用向上移动，到达质控线，无羊抗鼠IgG（二抗）或破坏失效，不结合而不显色，作为质控对照免疫血清的制备 概述免疫血清：含有某种抗体的血清。它是免疫化学和细胞免疫的主要试剂，其质量的好坏由Ab的效价、特异性决定来源：由Ag免疫动物而来（Ag可以是纯Ag，如白蛋白，也可以是复杂Ag，如人全血清） 免疫血清的制备主要程序：选择免疫动物-选择抗原-（应用佐剂）-进行免疫-（间隔，多途径）试血-放血-纯化-鉴定-保存动物的选择：1.常用动物：哺乳类较多：马、羊、猪、猴、兔豚鼠等；禽类：鸡2.选择原则：免疫的Ag及动物的种类要求越远越好（即免疫原性好）；及免疫血清的量有关：所需量大，用马、羊、猴等大动物；所需量小，用兔、豚鼠等小动物；动物的个体状态：雄性、适龄、健康、无感染；其它：根据实验的特殊要求。抗原的条件：具有良好的抗原决定簇（表位）：易被LC识别而产生Ab；具有可靠的纯度；足够大的分子量及相对复杂的空间结构；注射量：严格掌握。宁可小，一般用25µg/kg动物；量大可出现免疫抑制佐剂的应用：佐剂（adjuvant）：同Ag一起或预先注入机体，能增强机体对该Ag的免疫应答或改变免疫应答类型的物质（多用于可溶性Ag，颗粒性Ag一般不用佐剂）使用佐剂的目的：增加Ag的免疫原性，从而提高抗血清的效价福氏不完全佐剂（FIA）组成：羊毛脂石腊油，二者比例为4：1制备：将Ag溶液逐滴加入羊毛脂和石蜡油中，不断研磨，使Ag均匀混于佐剂中，形成“油包水”乳剂要形成“油包水”乳剂的原因：延缓Ag在体内的破坏和消失，并缓慢释放Ag；刺激单核-巨噬细胞对抗原的处理和提呈能力；促进淋巴细胞的增殖、分化从而增强机体的免疫应答福氏完全佐剂（FCA）组成：羊毛脂石腊油卡介苗表现：促进、诱发Ag产生强大、持久的细胞免疫反应；促使机体合成新的Ig种类特点：卡介苗同Ag一起加入到羊毛脂和石蜡油中，几滴即可；免疫效果更好；注射局部易形成肉芽肿，溃烂，但对Ab生成无危害注射途径：常用的有：静脉、皮内、皮下、淋巴结、腹腔，采用一种途径多点注射可溶性Ag：常选用皮内或皮下（皮内易引起细胞免疫反应，对产生Ab有利）颗粒性Ag：常选用静脉或腹腔若Ag量少，可直接注射淋巴结注射间隔及次数：单次注射：Ab生成慢、持续时间短、效价低，但特异性好再次注射：注射两次，Ab效价上升快，持续时间长间隔一定时间多次注射：Ab效价高、生成时间长，但特异性差，一般为715天一般采用后两种注射方法注射量：蛋白质Ag一般注射14mg/次，注射量过大易形成免疫耐受试血：末次Ag注射后，测定血清中Ab的效价，若Ab达到所需效价，即刻放血，若未达到，继续追加免疫一次放血：直接颈动脉放血或直接心脏穿刺抽血，然后分离出血清，即可得到AbAb效价判定：以出现明显凝集现象的（记为+凝集）抗体最高稀释度为该抗体的效价（滴度Titer）鉴定：Ab效价的鉴定：可溶性Ag：双扩，梅花孔型；颗粒性Ag：用直接凝集试验，试管法Ab特异性的鉴定：双扩法（双孔型）方法：在琼脂上打两排孔，左边一侧一孔加粗Ag（Ag粗提物），一孔加纯Ag（特异性Ag），右边一侧两孔分别加抗血清，放37，24h结果：若抗血清及粗Ag和纯Ag之间皆出现一条沉淀线，且两条线融合，则说明动物易产生单价特异性Ab；若及纯Ag出现一条线，及粗Ag出现多条线，则说明有杂AbAb纯度的鉴定：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，若出现多条电泳带，即提示抗血清中杂蛋白较多，需进一步纯化保存：小包装低温保存：-20，避免反复冻融，可保存5年，效价不下降冰冻干燥保存：用冰冻干燥器使免疫血清形成冻干粉，可保存510年4加防腐剂保存：可保存半年免疫球蛋白的分离提纯 目的有利标记；减少非特异反应；有利Ig定量 分离提纯方法（原理）：一般选用23种，或同一方法反复进行23次盐析法：在不同浓度的中性盐中蛋白质会脱水，降低带电电势，亲水性变为疏水性，分子间相互凝聚而沉淀（盐析作用）。不同蛋白质盐析所需中性盐的浓度不同，故可分离不同蛋白质。常用中性盐：硫酸铵分析纯试剂离子交换层析法：利用不同的蛋白质在缓冲溶液中所带电荷不同，及某一载体上的具有相反电荷的离子基团进行吸附，然后进行解脱，达到纯化蛋白质目的。常用载体：纤维素DEAE，带正电，吸附带负电的Alb、球蛋白凝胶过滤法：凝胶颗粒是网状结构，当分子大小不同的混合物通过凝胶柱时，分子大的先下来，分子小的嵌入凝胶颗粒的网状结构中后下来，从而将分子大小不同的物质分离开来，即为分子筛的作用。常用凝胶：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶，分离Ig多用G150亲和层析法：利用抗原抗体的结合具有特异性、可逆性，将纯化抗原先交联到载体（琼脂糖珠）上，制成亲和层析柱，当Ab（Ig）通过时，及抗原特异性结合在柱上，Ab中杂质流出。然后通过改变缓冲液 pH、离子强度，使Ab解脱下来。单克隆抗体及应用 概述克隆：无性繁殖的细胞株单克隆：由一个细胞无性繁殖而来的一个细胞株（一团细胞），其中所有细胞特性完全一样 单克隆抗体（McAb or mAb）针对Ag分子表面某一抗原决定簇（又称表位）而产生的抗体分子，称McAb由一个B细胞克隆产生的识别单一抗原表位的同源抗体。 制备McAb的方法杂交瘤技术、基因工程技术 杂交瘤技术制备单克隆抗体的原理及简要步骤原理：能产生抗体的小鼠B(浆)细胞及小鼠骨髓瘤细胞杂交能生成分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞简要步骤：1.制备能产生单抗的杂交瘤细胞2.克隆化杂交瘤细胞3.筛选杂交瘤细胞 4.扩大培养单克隆杂交瘤细胞5.收集单抗并鉴定6.纯化单抗 B细胞（浆细胞）特点能产生抗体，但不能在体外长期培养，细胞内含HGPRT酶和TK酶，可通过旁路途径合成DNA 骨髓瘤细胞特点能在体外长期培养，不含HGPRT和TK酶 杂交瘤细胞含两种共性既能产生抗体，在体外能长期培养；同时含有HGPRT和TK酶，可通过旁路途径合成DNA HAT培养液的作用(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）氨基蝶呤是抗代谢的药物，能阻断内源性合成DNA（合成DNA的主要途径），选出杂交瘤细胞 浆细胞/瘤细胞杂交瘤细胞：可以生长HAT培养液中氨基蝶呤阻止DNA合成；但其含有HGPRT、TK酶，可通过旁路途径合成DNA杂交瘤技术制备McAb 制备杂交瘤细胞制备能产生McAb的小鼠B细胞：Ag免疫Ba1b/c小鼠测抗体取脾制备脾细胞悬液计数细胞融合：脾细胞（B）+小鼠骨髓瘤细胞杂交（脾细胞15X107/ml，瘤细胞1078/ml）融合剂：40%聚乙二醇（PEG）筛选：培养过程中加入HAT培养液，培养14天，存活细胞为杂交瘤细胞 鉴定：将筛选出的能产生所需抗体的杂交瘤细胞进行鉴定方法：检测杂交瘤细胞培养的上清液中有无目的Ab，常用ELISA、IF间接法包被已知Ag+杂交瘤细胞培养上清（Ab？）洗涤，+酶标羊抗鼠IgG洗涤，+底物根据显色判断有无特异Ab 克隆化有限稀释法：特异性杂交瘤细胞稀释：710个/ml，取0.1ml/孔，反复稀释培养，经ELISA间接法筛选、检测特异抗体显微操作法：直接在显微镜下取单个杂交瘤细胞培养、测特异抗体（筛选和克隆化应反复交叉进行） 冻存或扩大培养在液氮中冻存鉴定后的杂交瘤细胞备用，需要时复苏扩大培养（增殖），可得到大量单克隆抗体体外法：将杂交瘤细胞在细胞培养瓶中进行培养，传代体内法：将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内，利用它具有瘤细胞的特点能大量繁殖，产生腹水，腹水中有大量的单抗 鉴定聚丙烯酰胺凝胶鉴定单克隆抗体的纯度用ELISA、免疫电泳法鉴定抗体特异性 纯化盐析法、离子交换层析法、凝胶过滤法、亲和层析法（任选12种） 杂交瘤技术制McAb的优缺点优点：制备的单抗特异性高、效价高、产量高缺点：需特殊条件、无菌操作、难得到稳定细胞株；抗体为抗鼠的IgG抗体，长期用于人体不利 人源单克隆抗体单克隆抗体为人IgG，用于人基因工程抗体 基因工程抗体在基因水平上对编码抗体的基因进行切割、拼接或修饰，甚至人工合成，然后导入受体细胞内表达而产生的抗体（单克隆抗体） 嵌合抗体用DNA 重组技术将鼠源单抗基因的可变区（V区）基因及产生人Ig的恒定区（C区）基因相连接，构成嵌合基因，导入受体细胞（骨髓瘤细胞），表达出嵌合抗体 嵌合基因：红色-鼠McAb可变区基因；绿色-人Ig的恒定区基因 嵌合抗体：可变区为鼠McAb部分，其它部分为人Ig部分 构建成功的嵌合抗体抗乳腺癌（1986），抗结肠癌（1987），抗肺癌（1987），抗CEA（癌胚抗原1989），抗HBsAg（1990我国），抗T表面受体BMAO31-IgG（1991我国） 嵌合抗体的优点a.免疫原性低，有利于用于人体b.在人体内半衰期较鼠单抗长c.在人体内生物学作用（如CDC、ADCC）较鼠单抗强d.及人/人杂交瘤比，体外传代更稳定 重构抗体（Reshaped Antibody）以人Ig基因为框架，去掉高变区部分，用鼠单抗高变区基因连接上，构成重构基因，倒入受体细胞表达出的抗体 重构基因：绿色为人Ig基因（框架），红色为鼠McAb基因（高变区部位基因） 重构抗体：所有绿色部分均为人源，红色部分为鼠源（CDR） 单链抗体（具有结合抗原活性的单链蛋白）是一种新的重组多肽，由一个人工设计的短多肽接头（基因）将编码轻链V区基因的C末端及编码重链V区基因的N末端相连接，然后整合到大肠杆菌基因上，表达出具有结合抗原特性的融合蛋白 单链抗体的优点分子小，在血清中比McAb或Fab段清除快无Fc段，免疫原性低较McAb更易进入实体瘤细胞周围微循环中可将多肽接头设计为具有特殊功能的位点如：金属螯合物、毒素、药物，用于影像、治疗等 单克隆抗体的应用细菌学方面用于诊断、研究病毒学方面快速诊断、病毒学研究、病毒性疾病的治疗和预防（单抗用于治疗，特异性高，所需量小，减少变态反应发生）肿瘤方面的应用诊断、肿瘤的治疗在寄生虫学方面及其他方面的应用补体的检测及应用 补体Complement是存在于人和动物血清中的一组具有酶活性的球蛋白，一般情况下处于未激活状态 补体的特性稳定性差，各种理化因素都可使之失活：如酸、碱、紫外线照射、剧烈震荡等实验室灭活补体的条件为：5630，室温23天也可自然失活补体检测必须用新鲜血清 补体的组成1.补体的固有成分：C1-C9,其中C1又包括C1q、C1r、C1s,共9种成分11种蛋白分子。其中C9的分子量最小、C3的含量最高2.补体的调节蛋白：如C4调节蛋白、C1抑制物、S蛋白等3.补体受体：如C1qR、C3aR等 补体的激活：三条途径经典激活途径：又称C1途径激活剂：IgG、IgM形成的AgAb复合物参及成分：C1C9激活过程：这是一个连锁反应，缺少其中任何一个组分，连锁反应都不能进行下去旁路激活途径：又称C3途径激活剂：脂多糖、酵母多糖、IgG4和IgA的聚合物（提供接触表面）参及成分：C3、C5C9、B因子、D因子、P因子甘露糖结合凝集素途径：又称MBL途径在感染早期，常采用前两个途径，产生Ab后采用第一个途径 补体的生物学作用溶菌、溶细胞作用（MAC效应）；调理作用（C3b、C4b和iC3b）；免疫黏附作用（C3b、C4b）；炎症介质作用：趋化作用（C3a，C5a）过敏毒素作用（C3a，C4a，C5a） 补体的检测功能检测：总补体活性的检测、单一补体活性的检测（溶血试验）量的检测：单一补体量的检测（免疫比浊法或单扩法） 溶血试验SRBC+兔抗SRBC抗体（溶血素）+新鲜血清（提供补体）启动经典激活途径（溶血）指示系统：绵羊红细胞和溶血素补体来源：多只豚鼠的混合血清 总补体活性检测：CH50试验原理：组成和功能完整的补体系统能使致敏羊红细胞发生溶血；羊红细胞的溶血程度及补体的活性成正比概念：在50溶血附近（3070%之间），稍微改变补体量，溶血程度变化明显，因此以50溶血率来判定终点较100更为敏感检测结果处理：最后找到及制备好的50%溶血标准管比较，取吸光度值最接近的一管，则CH50（U/ml）=1/血清用量X稀释倍数总补体活性参考范围：50100U/ml 单一补体活性的检测（溶血试验），常用于检测C3、C4、C1q、B因子等 单一补体量的测定：采用免疫比浊法或单扩法，常检测C3（含量12001300ug/ml） 补体检测的临床意义1.补体量：多见于急性炎症感染、组织损伤、癌肿2.补体量：见于补体消耗：体内有Ag、Ab 反应，如SLE、RA等；补体合成：肝脏疾患；补体先天性缺乏：具有遗传性和家族史 补体结合试验原理：补体可及任何一组AgAb复合物结合；一旦及某一复合物结合后，便不再及另一复合物结合结果判断：不溶血为阳性，即待测物中有相应的Ab或Ag；溶血为阴性，即待测物中无相应的Ab或Ag评价：优点：该试验既可测Ag、又可测Ab；Ag既可以是颗粒性Ag、也可是可溶性Ag、甚至可以是块状物，因此检测Ag的范围广；可以用于病毒、立克次氏体、细菌等多种病原体的检测（实际上是测Ag）；比较敏感(0.05g/ml)、特异；结果判断明显：通过有无溶血来观察，无需特殊仪器检测。缺点：参及反应的物质多，影响因素也多；（反应体系中有Ag、Ab、C、羊红细胞、溶血素）；在正式试验前需要找出几种物质间最恰当的比例，比较复杂机体免疫功能检测 免疫应答的类型及组成分为非特异性免疫应答和特异性免疫应答 人体免疫功能的组成成分非特异性免疫应答（固有性免疫应答）1.皮肤黏膜的机械阻挡作用及局部分泌的抑菌、杀菌物质2.吞噬细胞的吞噬作用3.NK细胞对病毒感染靶细胞的杀伤作用4.血液、体液中的抗菌分子：补体、溶菌酶特异性免疫应答（适应性免疫应答）细胞免疫：由TLC主导完成，其效应物质是致敏TLc(CTL/Th1)体液免疫