植物组织中可溶性糖含量的测定(3页).doc

-植物组织中可溶性糖含量的测定  在作物的碳素营养中， 作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为 NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。 蒽酮法测定可溶性糖一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长下进行比色。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料任何植物鲜样或干样。（二）试剂1. 80 乙醇。2. 葡萄糖标准溶液（ 100 g/mL ）：准确称取 100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至 100 mL ，使用时再稀释 10 倍（ 100 g/mL ）。3 蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸（将 98% 浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中） 1000 mL 中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用 2 3 周。（三） 仪器设备分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管（ 5 、 1 、 0.5 mL ），剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。三、实验步骤1. 样品中可溶性糖的提取 称取剪碎混匀的新鲜样品 0.5 1.0 g （或干样粉末 5 100 mg ），放入大试管中，加入 15 mL 蒸馏水，在沸水浴中煮沸 20 min ，取出冷却，过滤入 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。2. 标准曲线制作 取 6 支大试管，从 0 5 分别编号，按表 24-1 加入各试剂。表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量试 剂管 号012345100 g/mL 葡萄糖溶液（ mL ）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ mL ）1.00.80.60.40.20蒽酮试剂（ mL ）5.05.05.05.05.05.0葡萄糖量（ g ）020406080100将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮 10 min ，取出冷却，在 620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（ g ）为横坐标绘制标准曲线。3 样品测定 取待测样品提取液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL ，同以上操作显色测定光密度。重复 3 次。四、结果计算溶性糖含量（）从标准曲线查得糖的量（g）×提取液体积（ml）×稀释倍数/测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106×100式中： C 从标准曲线查得葡萄糖量， g 。V T 样品提取液总体积 , mL 。V 1 显色时取样品液量， mL 。W 样品重（ g ）。 苯酚法测定可溶性糖一、原理植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在 10 100mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在 485 nm 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定 160 min 以上。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料新鲜的植物叶片。（二）试剂1. 90 苯酚溶液：称取 90 g 苯酚（ AR ），加蒸馏水溶解并定容至 100 mL ，在室温下可保存数月。2. 9 苯酚溶液：取 3 mL 90 苯酚溶液，加蒸馏水至 30 mL ，现配现用。3. 浓硫酸（比重 1.84 ）。4. 1 蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在 80 下烘至恒重，精确称取 1.000 g ，加少量水溶解，移入 100 mL 容量瓶中，加入 0.5 mL 浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。5. 100 g/L 蔗糖标准液：精确吸取 1 蔗糖标准液 l mL 加入 100 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容。（三）仪器设备分光光度计，电炉，铝锅， 20 mL 刻度试管，刻度吸管 5 mL 1 支、 l mL 2 支，记号笔，吸水纸适量。三、实验步骤1 标准曲线的制作 取 20 mL 刻度试管 11 支，从 0 10 分别编号，按表 24 2 加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入 1mL 9 苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 5 20 s 时间加入 5 mL 浓硫酸，摇匀。比色液总体积为 8 mL ，在室温下放置 30 min ，显色。然后以空白为参比，在 485 nm 波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。表 24-2 苯酚法测可溶性糖绘制标准曲线的试剂量试 剂管 号01 、 23 、 45 、 67 、 89 、 10100g/L 蔗糖标准液（ mL ）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ mL ）2.01.81.61.41.21.0蔗糖量（ g ）0204060801002 可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取 0.1 0.3 g, 共 3 份，分别放入 3 支刻度试管中，加入 5 10 mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取 30 min （提取 2 次），提取液过滤入 25 mL 容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。3 测定 吸取 0.5 mL 样品液于试管中（重复 2 次），加蒸馏水 1.5 mL ，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，计算测试样品中糖含量。四、结果计算可溶性糖含量（）从标准曲线查得糖的量（g）×提取液体积（ml）×稀释倍数/测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106×100式中： C 标准方程求得糖量， g 。V T 提取液体积， mL 。V 1 吸取样品液体积， mL 。W 组织重量， g 。-第 3 页-